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ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.28 No.1 pp.49-55
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2013.28.1.49

한우의 번식 효율 향상을 위한 자궁 내 세균 분석

박정준1, 유한준1, 조영재2, 최혜원1, 윤필상1, 이선구3, 정배동2, 한태욱2,*
1ARBC, 2강원대학교 수의과대학 및 동물의학종합연구소, 3상지대학교 한의과대학

Analysis of Uterine Bacteria to Increase Reproductive Efficiency in Hanwoo(Korean Native Cattle)

Tae-Wook Hahn2,*, Joung-Jun Park1, Han-Jun Yoo1, Young-Jae Cho2, Hye-Won Choi1, Pil-Sang Yoon1, Seon-Goo Lee3, Bae-Dong Jung2
2College of Veterinary Medicine & Institute of Veterinary Science, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea
1Animal Reproduction & Biotechnology Center, Hoengseong 225-807, Korea
3College of Oriental Medicine, Sangji University, Wonju 220-710, Korea

Abstract

The objective of this study was to evaluate several types of uterine bacteria in Hanwoo. uterine bacteria from randomlyselected 5 uterus was collected by flushing methods into a sterilized 1.5 ml centrifuge tube and was inoculatedonto MacConkey agar and blood agar, respectively. After being incubated for 5% CO2, aerobic or anaerobic conditionat 37℃ during 48h, bacterial colonies were selected and re-inoculated onto blood agar plates. Re-cultured colonieswere identified by Gram staining and finally identified using Vitek system. The identified bacteria were Staphylococcuslentus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus warneri of Gram (+) and Rhizobiumradiobacter, Sphingomonas paucimobilis of Gram (-) bacteria. Although, pathogenicity of identified bacteria wasunclear, the bacteria can have an effect on the uterine microenvironment. Therefore, repetitive research will be requiredto determine the effects of bacteria in cattle exposed to a various environment.

08(09) 한태욱_가편집+1교+저자2+가제본2.pdf454.6KB

서 론

 최근 한우 번식우의 사육형태가 대규모화됨에 따라 개체관리 및 질병관리 미흡 등으로 인하여 무발정, 둔성발정, 미약발정 등의 번식장애 발현으로 인공 수정 시 첫 종부의 낮은 수태율, 인공 수정 횟수 증가, 공태기간 연장, 호르몬 제제 사용, 수의 진료 등 경영비용을 비롯한 송아지 생산 비용의 증가와 쇠고기 품질의 저하로까지 이어져 농가 소득을 감소시키고 있다. 현재 발생되고 있는 번식장애의 현황에 대하여 이와 임(1982) 및 임과 정 등(1984)은 도축되는 번식우의 생식기에서 병적 이상이 발견된 경우를 번식 장애우로 판정한 결과, 번식장애 발생율은 한우가 33.3%, 젖소가 55.2%로서 총 41%의 도축 암소에서 번식기관의 이상이 발견되었으며, 번식기관별로는 자궁 내막염 등 자궁 질환이 46%, 난소낭종 등 난소 질환이 32%, 유방염과 같은 유방 질환이 8%로서 번식장애의 대부분은 자궁과 난소의 이상이라고 보고하였다. 또한 산차(김 등, 1981) 및 연령(이, 1969)이 높을수록 번식 장애우의 발생 비율이 상승한다고 보고된 반면, 김 등(2002)은 산차에 따른 번식 장애 분포가 미경산우 50.7%, 2산차 22.0%, 3산차 12.9%, 4산차 7.7%, 5산차 6.7%로서 산차가 늘어남에 따라 번식 장애의 비율이 낮아진다는 보고와 연령(변과 조, 1973)이 증가할수록 그 비율이 낮아진다는 상반된 보고도 있었다. 한편, 백 등(1997)은 번식 장애의 발생 유형 중 저수태우(repeat breeder syndrome; RBS)가 가장 높은 비율을 차지한다고 보고하였다. 저수태우의 주요 원인으로는 무배란성 발정, 지연배란, 수태장해, 영양, 생식기관의 감염, 초기배 사멸 및 태아의 조기사 등 여러 가지로 보고되었으며(Bulman 등, 1978; Kimura 등, 1987; Swanson 등, 1990; Bartlett 등, 1986), 저수태우의 비율은 미경산우 10.0~40.0%, 경산우 6.8~45.6%, 그리고 우군 평균 22.8%로 조사된 것으로 보고되었다(Moss 등, 2002). 또한, 저수태우는 정액 손실과 인공 수정 비용의 과다 지출, 수태간격 증가, 수의진료 비용 발생, 도태 및 세대간격 증가로 인한 수익성 저하를 초래하므로 소의 경제적인 손실의 주요 요인이다(Bartlett 등, 1986). 원인이 불분명한 저수태우와 경관염 및 내막염과 같은 자궁 유래 질환의 경우는 그 발생빈도가 높음에도 불구하고, 국내외적으로 소 번식장애의 유형별 진단 및 유형별 치료방법에 대해 체계적으로 제시한 자료가 미미한 상태이다(조 등, 2001). 이러한 번식장애의 원인 중 하나인 출산 후 세균에 의한 자궁의 오염은 일반적인 것으로 대부분의 건강한 암소는 출산 후 2∼3주 내로 자궁으로부터 세균의 제거가 가능하다. 그럼에도 불구하고 주로 Actinomyces pyogenes와 Bacteroides와 같은 혐기성 균에 의해 지속감염이 일어나는데, 특히 Bacteroides는 호중구의 주화성 작용과 탐식작용을 감소시켜 Bacteroides 자신과 A.pyogenes가 지속적으로 자궁 내에 머물러 있게 하며, A. pyogenes는 자궁내막에 염증성 손상을 일으키는 균으로서 출산 후 3∼4주 이상 자궁 내에 A. pyogenes가 감염되어 있는 소는 수태율이 저하된다고 보고되었다(Studer와 Morrow, 1978; Miller 등, 1980; Bonnett 등, 1993). 한편, 임신에 필요한 사이토카인 분비는 자궁 내 미생물에 의해 크게 영향을 받을 수 있으며, 특히 대식세포는 TLRs 및 C-type lectins 등과 같이 미생물을 인지하는 수용체를 가지고 있어 자궁 내 미생물 인지에 중요한 역할을 담당한다고 보고되었다(Kajikawa 등, 1998; Wang 등, 2003; Ilievski 등, 2007; Koga 등, 2009; Thaxton 등, 2009). 또한 대식세포는 임신에 필요한 여러 사이토카인을 직접 분비할 뿐만 아니라, 자궁 내 미생물을 인식하여 염증성 사이토카인의 분비와 면역 억제 사이토카인의 분비 및 감소작용을 유발시킨다고 보고되었다(Coffelt 등, 2009). 이와 같이 자궁 내 미생물에 의하여 면역세포의 염증성 사이토카인의 분비 변화가 유도되며, 이는 자궁내막의 정상적 임신 관련인자의 합성의 변화를 야기하게 되므로 자궁 내 미생물의 환경 변화는 수태율의 변화를 초래할 수도 있다.

 그러므로 본 연구는 한우의 수태율 향상을 비롯한 번식 효율을 증진시키기 위하여 지속적으로 한우에서 관찰되는 번식장애에 의한 번식 효율 저하의 원인을 파악하고, 한우 자궁 내 서식하는 세균총의 분포를 분석하고자 수행되었다.

재료 및 방법

1. 자궁 내 미생물 수집

 한우 암소 번식우를 대상우로 하여 미발정주기의 암소 006, 066, 017, 229, 047 개체의 자궁 세척액을 멸균된 1.5 ml centrifuge tube를 이용하여 수집하였다. 채취된 자궁 내 세균이 담긴 tube는 즉시 얼음이 담긴 아이스박스에 넣어 실험실로 운반하였다. 세균의 배양은 자궁세척액이 실험실에 도착하는 즉시 MacConkey agar(Difco, USA)와 혈액 배지(코메드, 대한민국)에 접종하여 실시되었다. 또한 인공 수정에 의한 자궁 내 세균의 감염 여부를 판단하기 위하여 Bull No. 1~5개체의 동결정액을 대상으로 세균배양을 수행하였다.

2. 소 자궁세척액/정액 내 세균의 검사

 자궁세척액 및 정액 시료를 적당히 vortexing한 후 MacConkey agar(Difco, USA)와 5% 면양 혈청이 첨가된 혈액 배지(코메드, 대한민국)에 각각100 μl씩 도말하였다. 37℃에서 산소의 공급 차이에 따라 배양조건을 각각 세 조건으로 하여 배양하였는데, 일반호기성 배양조건, 5% CO2 incubator가 첨가된 배양조건, 혐기성 배양 jar(BD Diagnostics, Sparks, Maryland, USA)를 이용하여 48시간 배양하였다. 관찰된 집락을 다시 새로운 혈액 배지에 접종한 후 동일한 조건으로 배양하여 세균동정을 실시하였다. 배양된 Colony를 Gram Stain한 후 그램염색성 및 형태를 확인하여 VITEK® system(bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA)를 이용해서 최종 균을 동정하였다.

3. 항생제 감수성 검사

 자궁세척액 및 정액 시료로부터 동정된 균을 각각 5 ml의 Muller Hinton Broth에 접종한 후, 37℃에서 150 rpm으로 4 h 동안 진탕배양하였다. MacFaland turbidity standard 0.5(BD Diagnostics, Sparks, Maryland, USA; 1~2×108 CFU/ml)를 이용하여 sample을 PBS로 dilution시켜 맞춘 다음, Sterilized cotton swab으로 배양액에 담근 후 Muller Hinton Agar에 3번 도말하고, 표면이 마르기 전에 다양한 항생제 Disc(Table 2, 3,5)를 올려놓고, 37℃에서 24 h 동안 Incubation 하였다. 실험에 이용된 항생제 Disc는 Duchefa Biochemie 사(Haarlem, Netherlands)로부터 ampicillin, amoxicillin, gentamicin, kanamycin, nalidixic acid, tetracyclin이 구입되었고, Sigma Chemical 사(St. Louis, MO, USA)로부터 sulbactam, clavulanic acid, cephalothin, neomycin, sulfamethoxazole, trimethoprim이 구입되어 사용되었다. 자궁세척액 샘플은 호기성 및 혐기성에서 incubation되었으며, 정액 샘플은 호기성에서만 incubation되었다. 배양 후 plate의 직경을 mm 단위로 측정하여 Zone Diameter Interpretive Chart(BD Diagnostics, Sparks, Maryland, USA)에 따라 세 등급(Resistant, Intermediate, Susceptible)으로 나누어 판정하였다.

결 과

1. 한우 자궁 내 미생물상 조사

 한우 5두 중 한우 006에서는 Rhizobium radiobacter, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus lentus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus vitulinus의 5종의 균들이 발견이 되었으며, 한우 066에서는 3종류(Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus lentus, Staphylococcus warneri)의 균들이 발견이 되었고, 한우 017에서는 2종류(Rhizobium radiobacter, Sphingomonas paucimobilis), 한우 229(Rhizobium radiobacter)와 한우 047(Sphingomonas paucimobilis)에서는 각각 1종류의 균이 검출되었다(Table 1). 또한, Rhizobium radiobacter 및 Sphingomonas paucimobilis는 4개의 한우 샘플에서 발견되었다. Aerobic incubation 상에선, 4종의 균들(Rhizobium radiobacter, Staphylococcus lentus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus vitulinus)이 발견되었고, anaerobic incubation 상에서는 Rhizobium radiobacter, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus lentus, Staphylococcus warneri가 발견되었다. 모든 샘플에서 한 strain 이상의 균이 관찰되었다.

Table 1. Identified bacterial species in Hanwoo uterus flushing

2. 한우 자궁 내에서 분리 동정된 미생물의 항생제 감수성 검사

 한우 자궁 내 미생물의 항생제 감수성 조사를 위해 10개의 항생제에 대한 한우 자궁세척액에서 분리 동정된 6개의 균들의 감수성이 검사되었다(Table 2, 3). 호기성 환경에서 배양된 균들의 항생제 감수성 실험 결과, Staphylococcus sciuri를 제외한 모든 균에서 항생제 ampicillin에 대해 내성이 보였다(Table 2). 항생제 nalidixic acid에 대해선 Staphylococcus warneri는 강한 내성을 보였고, 그 외 5종의 균들은 intermediate 내성을 보였다. 또한 모든 균은 nalidixic acid 상에서 비정형적인 원형의 morphology를 보여 주었다. 혐기성 환경에서 배양된 균들의 항생제 감수성 실험 결과, Staphylococcus lentus는 ampicillin 및 nalidixic acid에 대하여, Staphylococcus warneri는 ampicillin과 nalidixic acid에 대하여, Sphingomonas paucimobilis는 cephalothin, kanamycin, tetracyclin에 대하여 내성을 보였다. 또한 Staphylococcus warneri와 Rhizobium radiobacter는 각각 sulfamethoxazole+trimethoprim 및 nalidixic aicd에 대하여 intermediate 내성을 보였다.

Table 2. Antibiotic sensitivity test of the bacteria in Hanwoo uterus flushing with aerobic incubation

Table 3. Antibiotic sensitivity test of the bacteria in Hanwoo uterus flushing with anaerobic incubation

3. 한우 정액 내 미생물상 조사

 동결정액 중 한우 Bull No.1에서는 Alicyclobacillus acidoterrestris, Kocuria rosea, Micrococcus luteus, Pasteurella canis, Sphingomonas paucimobllis의 5종류의 균이 발견되었고, 한우 Bull No.2에서는 1종류(Alicyclobacillus acidoterrestris)의 균이 발견이 되었다(Table 4). 한우 Bull No.3에서는 2종류(Alicyclobacillus acidoterrestris, Kocuria rosea)의 균이 발견이 되었고, 한우 Bull No.4(Alicyclobacillus acidoterrestris, Micrococcus luteus, Sphingomonas paucimobllis)과 한우 Bull No.5(Alicyclobacillus acidoterrestris, Kocuria rosea, Sphingomonas paucimobllis)에서는 각각 3종류의 균이 관찰되었다. 또한, Alicyclobacillus acidoterrestris는 모든 한우에서 발견되었고, 다음 순으로 Kocuria rosea와 Sphingomonas paucimobllis가 3개의 한우 샘플에서 발견되었다. 모든 샘플에서 한 strain 이상의 균이 관찰되었다.

Table 4. Identified bacterial species in Hanwoo semen

4. 한우 정액에서 분리 동정된 미생물의 항생제 감수성 검사

 한우 정액 미생물의 항생제 감수성 조사를 위해 10개의 항생제에 대한 한우 정액에서 분리 동정된 3개의 균들의 감수성이 검사되었다(Table 5). 혐기성 환경에서 배양된 균들의 항생제 감수성 실험 결과, 세균 모두 kanamycin 및 nalidixic acid에 내성을 보였고, Alicyclobacillus acidoterrestris는 항생제 sulfamethoxazole+ trimethoprim에 대하여, Kocuria rosea는 항생제 cephalothin에 대하여, Sphingomonas paucimobilis는 cephalothin에 대하여 내성을 보였다. 또한 Alicyclobacillus acidoterrestris는 항생제 cephalothin, gentamicin, tetracyclin에 대하여 intermediate resistance를 보였다. 반면, Pasteurella canis와 Micrococcus luteus는 plate 상에서 균일하게 자라지 않아서 검사 자체가 불가능하였다.

Table 5. Antibiotics sensitivity test of Hanwoo semen

고 찰

 한우의 수태율 향상을 비롯한 번식 효율을 증진시키기 위하여 지속적으로 한우에서 관찰되는 번식장애에 의한 번식효율 저하의 원인을 파악하고자 한우 자궁 및 정액 내 미생물상의 분포와 분리 정제된 균의 항생제 내성이 분석되었다. 본 연구에서는 자궁 내 균의 동정을 위해, 전통적인 방법인 API 20E(bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA)와 생물학적 테스트보다 빠르고 정확한 VITEK® system이 사용되었으며, 많은 이전 연구에서 VITEK® system이 다른 테스트보다 실제 균종과의 높은 일치성을 보였다고 보고한 바 있다(Sader 등, 1995; Kim 등, 2008; 이 등, 2001). 분석 결과, 한우의 자궁 안은 무균상태이어야 함에도 불구하고, 모든 자궁세척액에서 균이 검출되었다. 발견된 균들은 Gram positive bacteria(Staphylococcus lentus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus warneri)와 Gram negative bacteria(Rhizobium radiobacter, Sphingomonas paucimobilis)로서 이들의 병원성은 크게 문제되지는 않으나, 균이 발견이 되는 자체가 자궁환경에 영향을 미칠 수 있다. R. radiobacter에 의한 감염증상이 사람의 대동맥판막 심장 내막염을 통해 보고된 후(Plotkin, 1980), R. radiobacter의 감염은 약화된 면역체계가 원인으로 알려져 있으며, 대부분의 환자에서 심신이 쇠약해지는 질병의 근원으로 보고되었다(Edmond 등, 1993; Blumberg와 Cherry, 1989; Hulse 등, 1993). 임상실험을 통하여 R. radiobacter 감염은 정맥 내 연결된 카테터를 통한 2차 감염으로 인한 혈균증을 나타내기도 한다고 보고되었다(Rodby와 Click, 1991; Mastoianni 등, 1996). 소에서 Staphylococcus warneri는 임신 5개월령에 유산된 태아의 폐, 간 및 위 조직으로부터 분리, 동정이 되어 Staphylococcus warneri의 유산 가능성이 제기된 바(Barigye 등, 2007) 있으며, 자궁 내 Staphylococci 또는 beta-haemolytic streptococci는 인공 수정 시 수태율을 저하시킬 수 있다고 보고된 바 있다(Easley 등, 1951; Gunter 등, 1955). 한편, 사람 불임 환자의 자궁경관과 사출정액으로부터 다양한 종류의 균들이 검출되었는데, Staphylococcus epidermidis (40%), Enterocooci (30%), Stereptococci (36%) 등으로 보고되었다(Eggert-Kruse 등, 1992).

 한우의 정액 또한 무균상태이어야 함에도 불구하고, 모든 샘플에서 균이 검출되었다. 발견된 균들은 Gram positive bacteria(Alicyclobacillus acidoterrestris, Kocuria rosea, Micrococcus luteus)와 Gram negative bacteria (Pasteurella canis, Sphingomonas paucimobilis)이다. 정액에서 분리 동정된 균들은 한우가 질병에 감염되어 나타날 수도 있지만, 일반적으로 정액을 채취할 때 한우의 피부나 포피, 또는 주위환경의 오염으로부터 기인한다고 알려져 있다. 돼지의 경우, 원정액에 주로 오염될 수 있는 균은 E. coli, Pseudomonas spp., Bacillus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Ciltrobacter spp. 등이다(Althouse와 Lu, 2005; Sone 등, 1982; Tamuli 등, 1984). 돼지 희석정액에서는 Acinetobacter lwoffi, Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia cepacia, Enterobacter cloacae, Enterococcus spp., E. coli, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas spp., Serratia marcescens, S. maltophila 등이 주로 분리되었으며, 분리된 세균의 대부분은 정자의 운동성 또는 생존성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Althouse 등, 2000; Althouse와 Lu, 2005; Althouse 등, 2008). 국내의 경우, 유 등(2008)은 Staphylococcus spp., Proteus spp., Serratia spp., Pasteurella spp., Acinetobacter spp., Serratia spp., E. coli 등이 주로 분리되었다고 하였으며, 박 등(2008)은 다소 높은 빈도로 Leclecia adecarboxylata, Acineobacter banmanni, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni spp. urealyticus, Proteus mirabilis가 발견되었다고 보고하였다. 오염된 세균의 종류가 본 연구 결과와 보고자들 간에 차이가 있는 이유는 정액채취 및 희석 방법의 차이 때문에 오염원이 다르게 발생한 것으로 생각된다. 본 연구 결과를 통하여 자궁과 동결정액으로부터 분리된 균 중 공통적으로 발견된 균은 Sphingomonas paucimobilis로 조사되었지만 Sphingomonas paucimobilis의 기능은 불명확하다.

 결론적으로, 자궁 내 균의 분포조사와 밝혀진 균총에 대한 조직병리학적인 연구 결과가 자궁 내 균 감염의 경로를 알아내고, 저수태우와 같이 원인이 불분명한 번식기능 이상증의 원인을 분석하는 접근방법으로 제시될 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 16s rRNA를 이용한 sequencing이 VITEK®  system로부터 도출된 결과의 검증을 위해 사용되어질 수 있을 것으로 생각된다. 분석된 다수의 균들은 기능이 불분명하지만, 자궁 내 분포된 균들은 다른 중요한 역할을 수행할 것이라 생각되며, 자궁 내 환경의 변화와 균 분포 간의 변이 시점 등의 상관관계 분석을 통하여 일시적 또는 지속적으로 발견되는 균과 해롭게 여겨지는 균들의 기능을 규명하는데 도움을 줄 것으로 생각되며, 번식기능에 미치는 영향을 판단하기 위해 다양한 환경에 노출되어 있는 한우를 대상으로 반복적인 연구가 지속되어야 할 것이다.

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