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ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.28 No.1 pp.1-6
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2013.28.1.1

돼지 배아줄기세포 확립을 위한 최적의 유도시기

김은혜, 정승아, 윤준철, 전유별, 현상환*
충북대학교 수의과대학 수의학과

Optimal Derivation Timing for Establishment of Porcine Embryonic Stem Cells

Sang-Hwan Hyun*, Eun-hye Kim, Seung-A Cheong, Junchul David Yoon, Yubyeol Jeon
Laboratory of Veterinary Embryology and Biotechnology, College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju-361-763, Republic of Korea

Abstract

A lot of works have been dedicated to clarify the reasons why the establishment of embryonic stem cells (ESCs)from pig is more difficult than that from mouse and human. Several concomitant factors such as culture conditionincluding feeder layer, sensitivity of cell to cell contact, definitive markers of pluripotency for evaluation of thevalidity and optimal timing of derivation have been suggested as the disturbing factors in the establishment of porcineESCs.
Traditionally, attempts to derive stem cells from porcine embryos have depend on protocols established for mouseESCs using inner cell mass (ICM) for the isolation and culture. And more recently, protocols used for primate ESCswere also applied. However, there is no report for the establishment of porcine ESCs. Indeed, ungulate speciesincluding pigs have crucial developmental differences unlike rodents and primates.
Here we will review recent studies about issues for establishment of porcine ESCs and discuss the promise andstrategies focusing on the timing for derivation and pluripotent state of porcine ESCs.

01(12) 현상환_가편집+1교+저자2+가제본2.pdf1.01MB

서 론

 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)가 마우스에서 처음 유도되어 확립된 이래로(Evans와 Kaufman, 1981), 지난 30년간 ESC에 관한 수많은 연구가 지속되었다. 돼지의 경우, porcine ESC(pESC)라고 추정되는 세포에 대한 보고서들은 다수 있었으나, 특성 분석이 완전하지 않은 배아줄기 유사세포(ES like cell)로 (Notarianni 등, 1990; Chen 등, 1999b), 현재까지 진정한 pESC는 존재하지 않으며, 그에 대한 어떠한 결론도 얻지 못한 상태에 있다(Brevini 등, 2007; Talbot와 Blomberg, 2008). 본 리뷰에서는 pESC의 유도를 위한 만능성 상태 및 적합한 유도시기 연구에 초점을 맞추어, 현재까지 pESC에 대해 보고된 연구현황을 살펴보고, 앞으로의 전망 및 전략에 대하여 설명하고자 한다.

진정한 pESC 확립의 한계

 pESC의 유도와 확립이 마우스나 인간에 비하여 어려운 이유에 대한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 배양조건에 관한 연구에서, Talbot 등은 porcine epiblast cells(pEpi)의 생존을 위해서 feeder cell는 필수적인 요소임을 주장하고 있다(Talbot 등, 1993). Feeder cell의 지지 없이는 pEpi 세포가 자라지 못하고, 10~14일이 지나면 노화되어 죽는다는 것이다. Porcine inner cell mass(pICM)을 단기간 일차 배양(primary culture)한 다른 연구에서도 feeder cell이 없다면 leukemia inhibitory factor(LIF)의 유무와는 무관하게 생존이 가능하지 않다는 결과를 제시하였다(Moore와 Piedrahita, 1997). 인간 ESC(hESC)의 경우, feeder cell이 없는 조건하에서 다양한 방법을 통해 배양이 가능하다는 것이 보고된 바 있고(Li 등, 2010; Nandivada 등, 2011), 돼지의 경우에는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)에서 feeder cell 없이 배양이 가능하다는 것이 최근에 보고된 바 있으나(Montserrat 등, 2012), pESC의 경우에는 아직까지 feeder cell이 필요하다고 알려져 있다.

 장기간의 세포배양을 유지하기 위한 또 다른 주요한 요소는 세포와 세포 사이의 접촉 민감도라고 주장하는 연구보고들도 있다. 특히 돼지를 포함한 발굽동물의 epiblast cells에서 이 문제는 더욱 두드러진다고 한다. 만능성 마커인 AP(alkaline phosphatase) 활성을 보이는 미분화 epiblast cells은 배양을 위한 과정 중 칼슘의 제거 및 트립신-EDTA와 같은 화학적 용해에 매우 민감하다(Talbot 등, 1993; Talbot 등, 1995). pEpi의 일차 배양을 위해 세포들이 완전히 떨어지도록 Ca2+/Mg2+free PBS에 5분간 노출시키면 세포들은 파괴되고 용해된다(Talbot와 Garrett, 2001). 이처럼 세포 간의 분리를 견디지 못하는 문제는 pEpi를 계대배양방법에 있어서 주요한 문제로 지적되고 있다.

 다음으로 돼지를 비롯한 가축의 ESC은 그 특성 분석이 지금까지 주로 형태학적인 기준으로 이루어져 왔으며, 최근까지도 이를 위한 특이적 분자 마커가 확인되지 않았다. 이는 연구 과정에서 확립한 ESC가 진정한 만능성을 갖추고 있음을 증명하기 위한 필수적인 정보의 부족으로 이어지고, 결국 그 유효성의 평가가 어려운 실정이다. 특히, 돼지의 경우 ESC의 OCT-4 단백질 발현에 관해서는 아직도 논쟁이 이어지고 있다. OCT-4가 ICM과 trophectoderm(TP) 모두에서 발현된다는 연구 결과가 많은 논문들에서 보고되어 왔다(Carlin 등, 2006, Blomberg 등, 2008, Kirchhof 등, 2000). 그러나 최근 한 연구에 의하면 돼지 TP와 내배엽 세포주에서만 OCT-4 유전자가 발현되었고(Keefer 등, 2007), Vejlsted 등은 OCT-4가 확장 배반포 혹은 부화 배반포의 ICM에서만 국한되어 나타났다고 보고하였다(Vejlsted 등, 2006b). 그 밖의 다른 만능성 마커들(Nanog, SSEA1, SSEA4, AP, Sox2, Rex1)의 발현에 대해서도 연구에 따른 데이터들이 다양하나, 서로 상충되어 pESC의 유효성 평가에 대한 기준이 아직도 명확하지 않다.

 pESC의 분리와 확립을 위한 최적의 타이밍에 대해서도 알려져 있지 않다. 즉, 현재로써는 연구마다 배아 발달 중 어느 시기에 배양을 시작하는 것이 pESC 확립을 위해 제일 적합한지 서로 상반된 주장을 하고 있다(Brevini 등, 2007). Chen 연구팀은 in vivo 유래 부화 초기 돼지 배반포의 TP 세포의 수가 상대적으로 매우 적으며, ICM은 덜 납작하다는 것을 발견했다(Chen 등, 1999a). 동일 논문에서 porcine ES like cell 배양확립의 성공률은 부화 초기 배반포를 이용한 것이 부화 후기 배반포를 이용한 것에 비하여 확실히 높았다. 그러나 동일한 in vivo 유래 돼지 배반포를 이용한 다른 연구자의 연구 결과(Hochereau-de Reviers와 Perreau, 1993), 수정 후 10~11일이 된 배반포에서는 ES like cell의 배양이 가능했던 반면에 5~6일 배아에서는 거의 배양되지 않는다는 결과를 보고한 바 있다. 이처럼 pESC 확립을 위한 배반포로부터 최적의 만능세포 분리시기에 관한 상반된 연구 결과들은 돼지에 있어서 배아발달의 시기에 이루어지는 과정 및 시기별 만능성 상태에 대한 연구의 필요성을 제시하고 있다.

초기 배아 발달 상태의 종별 차이

 pESC 확립을 위한 최적의 시기를 연구하기 위해서는 우선 초기 배아의 발달 양상, 특히 돼지가 마우스나 인간의 배아발달에 비해 어떠한 차이를 보이는지를 알아야 한다. 이처럼 만능성 세포주의 초기 발달 상태를 이해하는 것은 궁극적으로 세포치료를 위해 적합한 세포로 유도하는 초기 분화조건을 결정할 때에도 도움이 될 것이다.

 착상시기가 되면 포유류의 배반포는 독특한 세 개의 세포 계통으로 발달한다(Fig. 1). 우선, 상실배 후기에 처음으로 ICM과 TP이 형성되고, 이후에 ICM내 세포들은 다른 종류의 세포를 생산하는 능력을 얻기 위한 특별한 과정을 거치게 된다(Gardner와 Beddington, 1988). 이 과정이 지나면 ICM은 만능성을 지닌 epiblast와 배아 밖 계통인 hypoblast로 분화된다(Rossant, 2008). Epiblast를 덮고 있던 한쪽 끝 부위의 TP는 제거되고, 배아 원반(embryonic disc)이 형성된다. Epiblast는 기능적으로나 분자적으로나 할구와 초기 ICM과는 다르며, 세개의 종자층(외배엽, 중배엽, 내배엽)으로 분화되어 그 자체가 배아를 구성하는 모든 세포, 조직 및 기관을 이루게 되지만, hypoblast는 배아 밖 내배엽 및 난황주머니를 형성한다(Kaji 등, 2007; Gardner, 1998; Kurimoto 등, 2006). 이 시기에서 이처럼 세 가지 계통으로 분화하는 데 소요되는 시간은 종마다 차이가 있다. 사람에서는 약 6일 동안 이루어지는 과정이 돼지는 장기간 소요되며, pEpi의 형성은 배반포 부화시기에 시작되어 12일째 완성된다(Dvash와 Benvenisty, 2004; Vejlsted 등, 2006a). 이는 돼지의 배아 발달에 있어, 부화 이전에는 명확한 epiblast 시기가 존재하지 않는다는 것을 의미한다(Hunter, 1974). 동시에 마우스나 사람에 비해 착상 전 기간이 지연되어 만능성 세포의 분리를 위한 시간을 더욱 연장시켜 주게 되는데, 그 기간 중 pESC의 분리를 위해 가장 적합한 시점이 언제인지를 결정함에 있어 유용한 정보가 없는 실정이다.

Fig. 1. Cellular differentiation in blastocyst. (A) blastocyst, (B) early gastrula, RL: Rauber’s layer; ICM: inner cell mass; TP: trophectoderm; Epi: epiblast; Hypo: hypoblast; ED: embryonic disc.

만능성 상태 – naïve & primed

 마우스 ESC(mESC) 및 인간 ESC(hESC)들은 Oct4 발현, 자가 재생, 만능성과 같은 일반적인 특성을 공유하지만, mESC 및 hESC 사이에는 구분되는 차이가 있다. hESC는 epibast 형성 이전 단계에서 TP를 포함하는 모든 계통으로 갈 수 있는 경로가 열려 있으나, mESC는 배반포의 epiblast 전구체에서 이미 그 계통이 제한적임을 알 수 있다(Brons 등, 2007). 이러한 특성 차이는 인간 배아 발달 초기 단계에서의 계통제한이 마우스 배아 발달과 비교했을 때, 더 느린 속도로 이루어지는 것과 관련 있다. 그러나 최근 다른 연구팀은 이에 반하는 실험 결과를 발표하였다. 마우스 착상 후, 초기 epiblast에서 직접 얻은 mouse epiblast stem cell(mEpiSCs)라는 만능성 줄기세포주를 유도한 것이다(Brons 등, 2007).

 현재 이용 가능한 다양한 만능성 줄기세포주들은 만능성 상태에 따라 크게 두 가지로 분류된다(Nichols and Smith, 2009). Nichols와 Smith가 제안하는 두 가지 중 하나인 ‘naïve’ 줄기세포란 형태학적으로 작고 원형의 콜로니를 나타내고 LIF/-BMP4 신호체계를 요구하며, stage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1)을 발현하고, 암컷의 경우 두 개의 X염색체가 모두 활성화된 상태를 나타낸다(XaXa). Naïve 특성을 보이는 세포는 mESC와 mouse embryonic germ cell(mEGC)이 해당되며, 이들은 모든 유전적 재구성이 역분화되어 완전한 만능성을 지닌 상태이다. 반면에 또 다른 상태인 ‘primed’ 줄기세포란 납작한 형태로 NODAL/ACTIVIN 신호체계에 의지하고 SSEA-4를 발현하며, basic fibroblast growth factor(bFGF)를 요구하며, X염색체는 비활성화 상태 (XaXi)이다. 이러한 primed 특성을 보이는 세포는 mEpiSC와 hESC 등이 포함되며, 이는 제한된 만능성 상태를 의미한다(Fig. 2).

Fig. 2. The defferent pluripotent states of embryonic stem cells in vitro. ICM; inner cell mass; PICMI: post-ICM intermediate; mESC: mouse embryonic stem cell; mEGC: mouse embryonic germ cell; mEpiSC; mouse epiblast stem cell; hESC: human embryonic stem cell; pEpiSC; porcine epiblast stem cell.

 mESC는 bFGF와 Activin A 조건 하에서 EpiSC로 전환될 수 있다(Guo 등, 2009). 흥미롭게도 반대 방향으로의 전환, 즉 primed인 mEpiSC에서 naïve인 mESC로의 변화도 어렵지만 LIF와 2i상태 혹은 저산소 조건이나 Klf 조절 하에서 가능하다는 것이 밝혀졌다(Guo 등, 2009; Hanna 등, 2009; Lengner 등, 2010). 인간의 경우, 만능성을 가진 hESC는 보통 배반포 단계의 배아 속 ICM을 배양해서 얻는다(Chen 등, 2009). hESC는 NODAL/ACTIVIN 신호체계에 의존하고 bFGF를 요구하여, 마우스 ICM유래 줄기세포인 mESC의 특성이라기보다는 착상 후 발달단계의 배아에서 유래한 mEpiSCs와 더 유사하다(Brons 등, 2007; Tesar 등, 2007). 이는 hESC가 ICM이 아닌 착상 후 epiblast 초기상태와 사실상 더 유사하다는 것을 시사한다.

 이러한 동물별 및 만능성 특성별 모든 ES 유사세포들을 고려해 볼 때, pESC가 앞에서 제안한 두 가지의 만능성 상태에 포함되는지, 또는 동물별 만능성 상태를 평가할 수 있는 pESC의 특이적 특성 분석 기준이 필요한 것이 아닌지 고려된다. pESC는 형태학적으로 납작하고 단층의 콜로니를 보이며 NODAL/ACTIVIN 신호체계에 의지하므로 mEpiSC와 유사한 성질을 나타낸다고 밝혔다(Alberio 등, 2010). 또 다른 논문에서는 pESC를 Oct-4와 Klf4의 조절 하에 LIF에 의존적인 ‘naïve’ 상태로 유도했음을 보고하였다(Telugu 등, 2011). 그러나 돼지의 만능성 상태에 대한 유용한 정보는 아직도 상당히 부족한 상태로 궁극적으로 완전한 pESC의 확립을 위해서는 특성 분석에 관한 많은 연구가 필요하다.

최적의 타이밍을 찾기 위한 연구

 사실 hESC의 경우, ICM으로부터 ESC로의 최소한 1주일동안 이루어지는 세포학적 일련의 과정에 대해 알려진 바가 거의 없다. 인간의 ICM과 ESC는 유전자 발현양상에서 상당한 차이를 보이는데(Reijo Pera 등, 2009), O’Leary 등은 in vitro 상에서 hESC 확립시기에 세포학적 및 분자학적 변화에 대해 조사하였고, hESC를 유도하는 시기로 일시적 epiblast 유사구조인 ICM 후기 중간체(post ICM intermediate; PICMI)로부터 기원한다는 것을 증명하였다(O'Leary 등, 2012)(Fig. 2). 또한 O’Leary 등은 최근에 PICMI를 이용하여 hESC를 유도하는데 성공한 바 있다(O'Leary 등, 2013). PICMI는 in vivo 상에서 인간배아의 epiblast disc에 가깝다고 볼 수 있다. PICMI는 in vitro 상에서 안정적으로 확립된 새로운 만능성 상태가 아니라 ESC로 유도되기 전의 일시적인 상태이다

 인간보다 착상 전 시기가 긴 돼지에서도 ICM과 ESC 사이에 인간의 PICMI와 같은 특정한 시기가 존재할 수 있으며, 이러한 시기가 pESC를 확립하는데 최적의 시기가 될 수 있고, 이를 여러 방법으로 증명해 볼 필요가 있을 것이다. 그러나 현재 돼지의 배반포를 9일 이상 장기간 성장시킨 후에 이를 효율적으로 배양하는 배양체계는 확립되어 있지 않다. 소에서는 아가로스 겔(agarose gel)을 이용해 만든 터널에 부화 후 배반포를 지속적으로 성장시키는 실험을 진행하여 성공한 바있다(Vejlsted 등, 2006a). 그러나 돼지 배아는 in vitro 환경 하, 소의 배아에 비해 더욱 취약하므로 장기간 배양기법의 개발이 필요한 상황이다.

 돼지에서도 인간의 PICMI와 같은 시기가 존재한다면 ICM 보다는 효율적인 ESC의 전구세포로써 pESC의 만능성 상태에 대한 통찰을 가능하게 해주고, 나아가 pESC의 확립을 가능하게 해줄 수 있을 것이다.

전망 및 전략

 돼지는 해부학적, 생리학적, 대사적으로 영장류와 매우 유사하며, 중계의학 연구, 질병 치료, 이종 장기이식 등에 있어서 전 임상 모델로 인식되고 있어 전 세계적으로 돼지를 이용한 많은 연구모델이 개발되고 있다. 그럼에도 불구하고 ESC 연구 분야에 있어, 마우스, 랫드 및 인간의 경우에는 확립된 상태에 있으나, 돼지에서는 아직도 ESC 확립 연구가 진행 중이다. 본 실험실에서도 pESC 확립을 위한 최적의 조건을 찾기 위해 연구를 진행하고 있으나(Fig. 3), 아직까지 그 특성화 분석에는 제한적인 어려움이 있다.

Fig. 3. Putative porcine embryonic stem cell lines from porcine IVF blastocyst.

 전통적으로 pESC를 유도하기 위한 시도들은 mESC에서 확립된 프로토콜을 이용하였기 때문에 ICM 시기에서 이를 분리하고 배양하는 과정으로 이루어졌다. 그러나 이러한 방법을 이용한 이전 연구들의 진정한 pESC 확립 실패는 돼지에서는 배반포 단계가 줄기세포를 유도에 이용되기에 적합하지 않음을 보여주고 있는 것일 수 있다. 따라서 돼지의 종특이적 배아 발달단계를 고려하여, 부화 후 배반포를 효율적으로 배양할 수 있는 체외배양시스템을 개발하고, 이를 시기별 분리 후 배양환경을 구축한다면, 비로소 진정한 pESC을 확립할 수 있을 것으로 기대된다.

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