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ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.33 No.3 pp.99-105
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2018.33.3.99

The Expression of Matrix Metalloproteinases Activated Differently on In-Vitro Maturation of oocytes Cytoplasm and
Cumulus Cells in Bovine

Sang-Hwan Kim1, Jong-Taek Yoon1,2
1Institute of Genetic Engineering, Hankyong National University, Ansung 456-749, Korea.
2Department of Animal Life and Environment science, Graduate School of Future Convergence Technology, Hankyong National University, Anseong, Gyeonggi-do, 456-749
Correspondence: Taek Yoon Phone: +82-31-670-5094, Fax: +82-31-675-8265 E-mail: jtyoon@hknu.ac.kr
08/06/2018 17/09/2018 20/09/2018

Abstract


To determine the differences in the in-vitro ovum maturation process of bovine, we compared the expression of MMPs in these oocytes and cumulus cell throughout oocytes maturated. In an attempt to investigate the effect of MMP activation and inhibitors in total protein of cumulus cell and, oocytes during oocytes maturation, we examined and monitored the localization and expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9), TIMPs (TIMP-2 and TIMP-3), as well as their expression profiles (Real-time PCR, Gelatin Zymography and ELISA). Our results that the bovine oocytes MMP-2 and MMP-9 level was significantly associated with the rate of maturity of oocytes (P<0.05). In cumulus cell, MMP-2 was highly expressed in all stages of the oocyte’s maturation. The final oocytes maturation exhibited strong gelatinase activity. There was no significant correlation between cumulus cell MMP-9 and the maturation rate of oocytes. However, for the oocyte cytoplasm MMP-9 expression was significant correlation to the maturation oocytes. There was no significant correlation between cumulonimbus cells MMP-9 and oocyte maturation rates; however, for oocyte cytoplasm, MMP-9 expression was significantly correlated with mature oocyte. However, the TIMP-1 and TIMP-2 protein expression patterns are not correlated with the maturation rate of the oocyte. Our results suggest that MMP different expression pattern may regulate the morphological remodeling of oocyte's in the cumulus cell. Further, the MMP-2 expression has a strong relation with a higher maturation rate of the oocyte.



소 난자의 체외성숙시 난구세포와 난세포질에서 다르게 발현되는 Matrix Metalloproteinases의 분석

김 상환1, 윤 종택1,2
1한경대학교 유전공학 연구소
2한경대학교 동물생명환경과학과

초록


    서 론

    난자의 체외 성숙은 수정에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 특히 난자의 성숙은 몇 가지의 난구세포의 발달과정을 통해 난자의 발생 이 이루어진다. 이런 성숙단계에서 난자는 호르몬에 의한 생리학적 특성을 가지게 되는데 이는 난구세포의 팽화와 더불어 감수분열이 촉진되는 것으로 시사되고 있다 (Eppig, 1996). 특히 난자의 성숙은 cytoplasmic maturation으로 불리우며, 이는 cytoplasm에서 발생되는 survival 혹은 cell death process에 의한 성숙을 야기 시키는 것이다 (Eppig, 1996; Eppig et al., 1996). 즉 이런 세포질의 성숙은 핵의 성숙과정과는 무관하게 진행되는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포질과 단백질의 축적, 세포 핵의 재구성, 세포질의 재구성, 세포 신진대사 의 변화 등과 같은 세포 과정을 수반한다. 게다가, 성숙함에 도달하기 위해 성숙한 세포막은 난모 세포의 성장과 뒤잇는 세포 핵과 난세포 질 성숙도의 결과이다 (Eppig et al., 1996). 이와 같은 현상이 형성되는 동안 난세포질과 난구세포질은 서로 협력하여 초기 성숙 발달에 필요로 한 cytokine를 발산하고, 특정 호르몬에 대한 receptor 유전자의 방출을 활성화 한다. 이런 일련의 과정은 GVBD (germinal vesicle breakdown)시 receptor 유전자들의 전사를 중단시키고 핵의 분열 과정은 감수 분열의 중기 II까지 급속도로 진행된다. 그러나 난 세포질 내에서 발생되는 IGF-receptor에 의한 기전이 TNF-a나 혹은 apoptosis의 유발 등에 의하여 cell break이 형성되면 난 세포질에서는 핵의 분열을 중단 시키고 necrosis에 접어들게 된다. 이러한 현상들의 발생의 원인은 바로 난구세포의 부족으로 인한 원활한 호르몬 및 영양의 공급이 부족해지는 것으로 사료되고 있는데 난구세포와 난 세포질간의 상호 연계과정(microtubule에 의한 metabolism) 이 부족할 때 형성 된다. 난자 성숙 및 cell break현상에 있어 세포사멸과정은 매우 중요한 기전으로 보고 있는데, 특히 난구세포와 결합되어 성숙하는 난자의 경우 적절한 세포사멸이 형성된다고 알려져 있다 (Klionsky et al., 2007). 그러나 아직까지 난자의 형성과정에서 세포사멸이 유도 되거나 난구세포와 난 세포질간 세포재구성에 대한 연구 결과는 많지 않다. Thomas 등(2001)에 따르면 folliculogenesis 동안 얼마간 MMPs (Metrix metalloproteinases: 기저막분해효소) 기전에 의해 난포의 기저질의 재구성이 형성될 것이라 시사하였으며, 여러 연구 결과를 토대 로 난포의 MMPs가 발현하는 위치와 활성 양상은 난포의 구조적 변화 혹은 난자의 성숙 변화와 연관이 있다는 것을 보여주고 있다. MMPs 중 type IV collagenase인 MMP-2와 MMP-9은 기저막 성분 즉 laminin과 type IV collagenase을 선택적으로 분해한다(Huhtala et al., 1990). 이들은 대부분 세포 내에서 불활성화 된 pro-MMP 형태로 합성 및 분비되어 세포 밖에서 활성화되는데, 혈청 혹은 조직에서 기원한 TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases )들에 의해 세포 밖 환경에서 그 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다 (Brikedal-Hansen et al., 1993 ; Leco et al., 1994). 본 연구는 난자의 체외성숙 시 난구세포 및 난자의 세포질에서 MMPs의 발현 양상을 분석하고 이를 통하여 난자의 성숙과정에 난구세포 및 난자에서의 MMPs의 역할을 분석하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1 난자 체외 성숙

    도축장에서 도축된 한우의 난소를 35℃의 생리식염수 (0.85%)에 넣어 2시간 이내에 실험실로 운반하여 생리식염수로 3∼4회 세정하고 19 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기로 2∼6 mm의 난포에서 난포 액과 난자를 흡입, 채취하였다. 난자의 선별은 난구세포의 침밀도 에 따라 Wiemer 등(1991)의 방법에 따라 구별하여 선별하였다. 선별된 난자는 Hepes-buffered tissue culture medium-199(TCM-199; Gibco, 락빌, 메릴랜드, 미국)에 50 μg/ml의 gentamycin(SK chemical, 경기도, 한국), 0.3%(w:v) fatty acid free bovine serum albumin(BSA : Sigma, 세인트 루이스, 미주리, 미국)이 첨가된 기본 배양액으로 3∼4회 세정한 후, 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco), 2.5 μg/ml FSH(Sigma), 1 μg/ml estradiol-17β(Sigma), 20 μg/ml epidermal growth factor(Sigma) 및 50 μg/ml gentamycin(SK chemical)을 첨가한 TCM-199 성숙 배양액에 1∼2회 세정 후 같은 배양액이 well당 500 μl 담겨있는 4-well dish(Nunc, 로스킬레, 덴마크)에 각 well당 20∼25개의 난포란을 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기 내에서 24시간 동안 체외 성숙을 유도하 였다(Table 1).

    2 RNA 추출 및 cDNA 합성

    난자세포와 난구세포를 두 그룹으로 분리하여 각 그룹의 세포에서 RNA를 추출하기 위해 RNAqueous™Kit(Invitrogen, Grand Island, NY)의 실험방법을 응용하여 추출하였다. 이후 SupreScrip Ⅱ RT(Invitrogen, Grand Island, NY) 1㎕(50units)을 첨가한 뒤 42℃에서 3분간 정치 시킨 후 남아있는 RNA를 제거하기 위해 RNaseA 1㎕를 넣어 37℃에서 25분간 반응한 후 4℃에 정치한 후 합성된 cDNA는 RT-PCR을 실시할 때까지 -20℃에 보관하였다.

    cDNA 정량분석을 위한 SQRT-PCR

    cDNA를 18sr로 정량 하여 다음과 같이 PCR 증폭을 실시 하였다. GAPDH를 정량하기 위해 cDNA 1㎕과 PCR 반응약으로 10xPCR buffer(MgCl₂)2㎕, 2.5mM each dNTP Mixture(bio-online) 2.5㎕, Taq Polymerase 500units/100㎕(TnT, Seoul, Kor) 0.3 ㎕, 18srRNA Fw primer, Rv primer를 각각 1㎕씩 첨가하여 최종 부피 25㎕이 되도록 한다. Pre-denaturation 수행 후 Denaturation, Annealing, Extension을 시킨 후 Final extension을 실시 하였다. 실시 후 1% agarose에서 100v 30분간 전기영동을 실시한다.

    3 Real-Time PCR

    MMPs와 TIMPs mRNA의 분석을 위하여 On step SYBR RT-PCR Kit(TaKaRa, Japan)의 실험방법에 따라 실행되었으며, 사용된 유전자는 Table 2와 같다. Real-Time PCR 반응은 먼저 95℃에서 2분 동안 1회 실시하였고, 이후 증폭 step으로 95℃에 10초, 60℃에 서 10초, 72℃에서 15초로 40회 반복하였으며, 끝으로 72℃에서 5분 동안 1회 실시하여 분석하였다. 분석은 geometric 지역의 semi-logamplification plot에 기초한 cycle threshold(Ct)값에 주하여 분석하였고, 18sr 유전자를 표준화로 하여, 2-ΔΔCt 방법을 사용하 여 상대적 평가를 실시하였다.

    4 Gelatin Zymography

    난구세포가 제거된 난자, 난자 그리고 난구세포의 단백질 및 체외수정 이후 배양액에 Foz loading buffer(0.06% bromo phenol, 10% SDS, 2% glycerol)을 섞어 얼음 위에서 5분간 정치한 후 100mg/ml의 gelatin A/B가 포함된 12% SDS-Page gel를 사용하여 150V에서 1시간 30분 동안 전기영동 한 후 gel은 renaturation buffer(2.5% Triton X-100)로 20분간 2회 세척한 후, zymography reactive buffer 에 넣어 37℃에서 18시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 gel은 0.5% Coomassie blue R250(Bio-rad, USA) staining solution으로 1시간 동안 염색한 후 Destain solution(Bio-rad, USA)으로 탈 염색하여 활성화된 MMP-2, MMP-9을 분석하여 활성도를 측정하였다.

    5 ELISA

    배양 배지와 난자 단백질에서 특정 단백질의 발현량을 분석하기 위하여 96 well ELISA plate에 MMP-2 (ab78796, Abcam, Cambridge, UK), MMP-9(Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas USA), TIMP-2(sc-9905, Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas USA) 그리고 TIMP-3(sc-6836, Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas USA) primary antibody로 도포하여 4℃에서 하루 동안 coating 한 후, washing buffer(1 ×PBS with 2.5% Triton X-100)로 2회 세척하였다. 이 후 Blocking을 위해 1% SKmilk blocking solution으로 4℃에서 24시간 동안 blocking하였다. Washing buffer로 세척한 후 secondary anti-rabbit, (sc-2054, Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas USA)와 anti-mouse (sc-2054 and sc-2031, Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas USA) secondary antibody로 2시간 동안 detection하고, substrate solution(R&D Systems, USA)으로 반응시킨 후, 1 M NH2SO4로 반응을 중지시키고, 450 nm로 흡광도를 측정하였다. 단백질의 수준은 4개의 매개 변수에 의거한 (y = (A2D) / (1+ (x / C) ^ B) + D)에 고려한 표준 곡선에 따라 결정되었다.

    6 통계적 분석

    본 논문에서 얻어진 데이터들은 SPSS Statistics 20(SPSS, Korea)를 이용하여 T-test와 GLM(Generalized linear model) 방법으로 통계적 유의성을 분석하였다(p<0.05).

    결 과

    난자의 질적 평가에 따른 MMPs의 발현양상

    난자의 난구세포의 침밀도에 따라 MMP-9의 발현 및 활성도를 분석한 결과는 figure 1과 같다. 난구세포의 침밀도에 따라 24시간동 안 체외성숙을 유도한 후 각 등급별로 성숙된 난자(COC : cumulus oocyte complex)의 단백질에서 MMP-9의 활성은 1등급의 성숙된 난자에서 매우 높게 활성 되었으며(p<0.05), 등급이 낮아질수록 활성도 또한 점차 낮아졌다. 단백질의 발현 분석에서도 같은 결과를 보였으며, 1등급 성숙 난자에서 매우 높은 발현과 활성을 보였다(p<0.05). 반면, 그 외 등급에 따라 발현되는 MMP-9의 발현은 1등급(a) 2등급(b), 3등급(c) 그리고 4등급(d)의 순으로 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).

    난자와 난구세포에서 MMPs의 활성 분석

    난자의 세포질과 난구세포에서의 MMPs의 발현양상을 분석한 결과는 figure 2와 같다.

    COC 및 OC 그리고 CC의 단백질과 배양배지에서 MMPs의 활성도를 분석한 결과 배양배지의 경우 유의적 차이는 없었으나, active MMP-2와 단백질의 발현은 CC 배양 배지에서 상대적으로 높았으나 MMP-9의 경우 OC에서 높게 발현되었다(p<0.05). 반면, MMP-2 를 억제하는 TIMP-2와 MMP-9을 억제하는 TIMP-3의 경우 모든 군에서 비슷하게 발현되었으며, MMPs에 비하여 매우 낮은 농도로 나타났다. 각군의 단백질의 경우 대체적으로 배양배지보다 높은 발현양상을 보였으나 MMP-2의 경우 OC군에서 상대적으로 높은 발현 을 보였으나, 유의적 차이는 없었다. 그러나 MMP-9의 경우 OC에서는 매우 낮은 발현을 보였으나, COC와 CC에서 매우 높은 발현과 활성도를 보였다(p<0.05). 이에 반하여 TIMP의 발현은 CC에서 TIMP-2의 발현이 상대적으로 높았으며, TIMP-3의 발현은 OC와 CC 에서 COC에 비하여 높았다.

    난자와 난구세포에서 MMPs와 TIMPs mRNA 발현양상

    OC와 CC에서 MMPs와 TIMPs mRNA 발현양상을 분석한 결과는 figure 3과 같다.

    mRNA 발현도 단백질의 발현과 비슷한 양상을 보였으며, MMP-2와 9 모두 CC에서 높게 발현되었다(p<0.05). 그러나 TIMP-2의 경우 동일하게 발현되었으나, TIMP-3의 경우 OC에서 매우 높게 발현되었고 그에 비하여 CC는 낮게 발현되었다.

    고 찰

    난자의 성숙은 성공적인 수정을 위하여 성숙기를 가지는 가운데 많은 생리학적 작용에 따라 세포질의 재구성으로 인한 성숙을 이루 는 것으로 알려져 있다(Sakkas et al., 2001, Geary et al., 2013). 즉 난자의 성숙에 연관된 많은 proteinase process 중 MMPs의 작용 은 성숙에 매우 중요한 역할을 할 것이라 사료된다. 우리의 연구는 소의 난자가 체외에서 성숙 될 때 세포질의 재구성에 연관되어 MMPs의 활성이 난자세포질 및 난구세포에서 서로 다른 활성을 형성하는지를 통하여 세포질과 난구세포 사이의 MMPs에 의한 proteinases process에 대한 연관성을 분석하고자 하였다. 최근 연구에 따르면 matrix metalloproteinases (MMPs)는 난포 발육을 조절 하는 환경의 조성뿐만 아니라 배란과정에도 매우 중요한 역할을 한다(Goldman et al., 2004, Stamouli et al., 1996). 특히 MMP는 세포 외 기질 (ECM)의 모든 구성 요소를 분해할 수 있는 zinc endopeptidases의 계열이며 기질의 특이성에 따라 하위 그룹으로 나뉜다.

    우리의 연구는 MMP-2와 MMP-9에 대한 활성을 미성숙 난자의 각 등급별로 분석하였고, 분석결과에서 1등급의 성숙 난자의 경우 MMP-9의 활성이 매우 다른 하위 등급에 비하여 높았음을 확인하였다. 이 결과는 난세포의 기질 변화에 MMP-9의 영향이 높을 수 있다는 결과와 같았으며(Thomas et al., 2001), 난자의 성숙 시 MMP-9의 활성이 중요할 수 있음을 시사하였다. 특히 Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)와 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)는 gelatinases에 속하며 세포질의 재구성에 있어서 그 역할이 각기 달라진다는 보고가 있는데, 우리의 결과도 비슷한 양상을 보이는 것으로 확인 되었다(D’Ascenzo et al., 2004). 즉 난 세포질에서 의 MMP-9의 발현 주류를 이루는 반면 난구세포에서는 MMP-2의 발현이 주로 활성 되는 것으로 확인 되었는데, 이는 난구세포의 기질 변화와 난세포질의 기질 변화의 차이를 확인할 수 있는 결과라 할 수 있다. 그러나 난자의 성숙은 정자와의 수정을 위하여 난구세포 및 난자세포질의 차이성 있는 성숙을 한다는 것이라 볼 수 있는데(Laflamme et al., 2013) 이에 대한 MMPs의 활성은 수정에 관련된 기전에 밀접한 연관성을 가지는 것으로 사료된다. 즉 본 연구 결과에서 난자의 성숙 시 난구세포에서 MMP-2의 발현이 급증하는 것은 난구세포 팽화를 활성화함으로써 난자 성숙 및 성숙된 난자의 대사과정에 중요한 역할을 할 것이라 사료된다. 즉, 체외수정 시 성숙된 난포에서 MMPs 특히 MMP-9의 수치가 급증한 것이 수정률 및 임신률에 효과적이라는 보고처럼 난자의 성숙에 난구세포의 MMPs 활성은 매우 중요하다는 우리의 결과와 같다고 볼 수 있다(Lee et al., 2005, Horka et al., 2012). Brew 등(2010)의 연구에 따르면 MMP-TIMP 시스템은 성공적인 배란과 난자의 성숙에 있어 proteinase network와 관련되어 있다고 보고되어 있다. MMPs process는 세포질에서 발현되는 TIMPs에 의하여 성공적인 억제를 이루고, TIMPs의 발현은 MMPs를 억제함으로 인해서 재구성의 시작과 끝을 결정 짓는 것이라 볼 수 있다. 즉, Tissue-metalloproteinase-3 (TIMP-3)는 MMP-9에 대하여 친화성을 가지며, 결합으로 인하여 MMP-9의 활성을 억제하고, Tissue-metalloproteinase-2 (TIMP-2)는 MMP-2에 대해 더 높은 친화성을 갖고서 MMP-2를 억제하고 세 포 재구성을 완료하는 것으로 볼 수 있다. 난자의 성숙에 있어 MMP-2와 MMP-9의 발현은 상반된 결과를 보였고, 이에 따른 TIMPs의 발현 또한 MMPs와 다르게 활성 하였다(Gaide et al., 2012). Kim 등(2010)의 연구보고에 따르면 난자의 세포질과 난구세포에서의 MMPs와 TIMPs의 활성은 난자의 최종 성숙에 영향을 준다는 보고와 같이 우리의 연구에서는 난구세포의 MMPs의 활성과 세포질에서 의 MMPs의 발현에 차이가 있으며, 특히 세포질보다 난구세포에서의 MMPs process가 난자의 성숙에 매우 중요한 역할을 할 것이라 사료된다. 이러한 결과는 난자 및 난구세포를 배양한 배양액에서 MMP-9과 TIMP-3의 발현양상에서 차이를 보이고 있는데, 이는 난구 세포에서 형성되는 MMP-9의 발현이 난자에서 형성되는 MMP-9에 비하여 높게 발현함으로써 난자 성숙의 형태학적 변화를 이루는 것으로 사료되며, 이로 인하여 TIMP-3의 작용이 현저히 낮아지는 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 연구결과를 종합해볼 때 난자의 성숙에 MMPs의 기전은 난구세포에서 매우 높게 활성화되어 난자의 성숙을 유도하여 난자의 세포질을 성숙할 것이라 본다.

    Figure

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    Morphological analysis of Oocytes grade. A : oocytes grade, B : activation of MMP-9 by oocytes grade, C : expression of MMP-9 protein. The data are presented as average fold changes (mean ± SD) of three independent experiments. a,b,c,d P < 0.05.

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    MMPs expression by oocytes, cumulus oocyte complex and cumulus cell after maturation. A : activation of MMPs in oocytes and medium, B : ELISA analysis. The data are presented as average fold changes (mean ± SD) of three independent experiments. * P < 0.05. Oc : oocytes, OC+CC : oocytes-cumulus cell, CC : cumulus cell.

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    Expression of MMPs and TIMPs in the oocytes and cumulus cell. A : morphological, B : Real-Time PCR. The data are presented as average fold changes (mean ± SD) of three independent experiments. * P < 0.05. Oc : oocytes, CC : cumulus cell.

    Table

    Classification of condition in bovine oocytes

    PCR primers for MMPs and TIMPs gene used

    Reference

    1. BrewK and NagaseH . 2010. The tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): an ancient family with structural and functional diversity . Biochim. Biophys. Acta.1803:55-71.
    2. D'AscenzoS , GiustiI , MillimaggiD , MarciR , TatoneC , Cardigno ColonnaR , MoscariniM , PavanA , DoloV and CasertaD. 2004. Intrafollicular expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in normally ovulating women compared with patients undergoing in vitro fertilization treatment . Eur. J. Endocrinol.151:87-91.
    3. EppigJJ , O'BrienM and WigglesworthK . 1996. Mammalian oocyte growth and development in vitro . Mol. Reprod. Dev.44:260-273.
    4. EppigJJ . 1996. Coordination of nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in eutherian mammals . Reprod. Fertil. Dev.8:485-489.
    5. Gaide ChevronnayHP , SelvaisC , EmonardH , GalantC , MarbaixE and HenrietP . 2012. Regulation of matrix metalloproteinases activity studied in human endometrium as a paradigm of cyclic tissue breakdown and regeneration . Biochim. Biophys. Acta.1824:46-56.
    6. GearyTW , SmithMF , MacNeilMD , DayML , BridgesGA , PerryGA , AbreuFM , AtkinsJA , PohlerKG , JinksEM and MadsenCA . 2013. Triennial Reproduction Symposium: influence of follicular characteristics at ovulation on early embryonic survival . J. Anim. Sci.91:3014-3021.
    7. GoldmanS and ShalevE . 2004. MMPS and TIMPS in ovarian physiology and pathophysiology. Front Biosci. 9:2474-2483. Horka P, Malickova K, Jarosova R, Janatkova I, Zima T and Kalousova M. 2012. Matrix metalloproteinases in serum and the follicular fluid of women treated by in vitro fertilization . J. Assist. Reprod. Genet.29:1207-1212.
    8. HuhtalaP , ChowLT and TryggvasonK . 1990. Structure of the human type IV collagenase gene . J. Biol. Chem.265:11077-11082.
    9. KimSH , KangHA , KimDS , LeeMS , SeoKS , MinKS and YoonJT . 2010. Expression Analysis of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases from In vitro Maturation Oocytes Complexes in Porcine . Reprod. Dev. Biol.34:55-62.
    10. KlionskyDJ , CuervoAM , DunnWA Jr, et al.2007. How shall I eat thee? . Autophagy3:413-416.
    11. LaflammeBA and WolfnerMF . 2013. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid . Mol. Reprod. Dev.80:80-101.
    12. LecoKJ , KhokhaR , PavloffN , HawkesSP and EdwardsDR . 1994. Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) is an extracellular matrix-associated protein with a distinctive pattern of expression in mouse cells and tissues . J. Biol. Chem.269:9352-9360.
    13. LeeDM , LeeTK , SongHB and KimCH . 2005. The expression of matrix metalloproteinase-9 in human follicular fluid is associated with in vitro fertilisation pregnancy . BJOG. 112:946-941.
    14. SakkasD , PercivalG , D ArcyY , SharifK and AfnanM . 2001. Assessment of early cleaving in vitro fertilised human embryos at the 2-cell stage before transfer improves embryo selection . Fertil. Steril.6:1150-1156.
    15. StamouliA , O SullivanMJ , FrankelS , ThomasEJ and RichardsonMC . 1996. Suppression of matrix metalloproteinase production by hCG in cultures of human luteinized granulosa cells as a model for gonadotropin-induced luteal rescue . J. Reprod. Fertil.107:235-239.
    16. ThomasFH , LeaskR , SrsenV , RileySC , SpearsN and TelferEE . 2001. Effect of ascorbic acid on health and morphology of bovine preantral follicles during long-term culture . Reproduction122:487-495.
    17. WiemerKE , WatsonAJ , PolanskiV , McKennaAI , FickGH and SchultzGA . 1991. Effects of maturation and co-culture treatments on the developmental capacity of early bovine embryos . Mol. Reprod. Dev.30:330-338.