Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.33 No.3 pp.107-117
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2018.33.3.107

The Effect Estrogen and Testosterone on the Expression of Melanogenesis-related Genes in Korean Brindle Cattle

Hui-Gyeong Seo2, Ji-Hye Lee2, Sang-Hwan Kim1, Ho-Jun Lee1, Jong-Taek Yoon1,3
1Institute of Genetic Engineering, Hankyong National University, Ansung 456-749, Korea.
2Major in the Animal Biotechnology, Graduate School of Future Convergence Technology, Hankyong National University, Anseong, Gyeonggi-do, 456-749, Korea.
3Department of Animal Life Science, Hankyong National University, Ansung 456-749, Korea.
Correspondence: Jong Taek Yoon Phone: +82-31-670-5094, Fax: +82-31-675-8265 E-mail: jtyoon@hknu.ac.kr
08/06/2018 02/09/2018 20/09/2018

Abstract


The purpose of this study is to expression pattern of melanogenesis associate genes on cultured melanocyte layer cells in Korean Brindle Cattle(Dark, Brindle and Yellow) were analyzed to evaluate the effects of sex hormones on the control of melanogenesis pathways.



Korean Brindle Cattle(Dark, Brindle and Yellow) melanocyte in the skin cells was collected. after the addition of estrogen and testosterone, the culture was analyzed for expression of cell activity and melanin genes for 72 hours. For the analysis of estrogen in different coat color other than the melanogenesis-related genes it is increasingly yellow showed low expression. in particular, the cells of the brindle coat color is low active and expression of genes. However, the testosterone was low, the expression of cell activity inhibiting MMP-2. the expression of melanin genes actually showed a tendency to increase gradually, which is testosterone compared with the estrogen to be considered that affect the skin cell layer brindle coat color. In this study, stimulation with estrogen triggered the inhibition of MC1R of the melanocyte in brindle coat color, but testosterone is induced MC1R in melanocyte. Therefore, considered the eumelanin or phaeomelanin activation are controlled caused by differential expression of sex hormones on melanocyte in Korean Brindle Cattle.



칡소 모색별 피부세포 배양 시 Estrogen 과 Testosterone 첨가가 Melanogenesis 관련 유전자의 발현에 미치는 영향

서 희경2, 이 지혜2, 김 상환1, 이 호준1, 윤 종택1,3
1한경대학교 유전공학 연구소
2한경대학교 미래융합기술대학원 동물생명공학과
3한경대학교 동물생명환경과학과

초록


    서 론

    우리나라 토종 소인 칡소는 고유 유전자원으로 알려져 있으며, 경제형질면에서도 일반 한우(황우)와 차별성을 가지고 있다. 특히 칡소는 한우와 비교하였을때 성질이 온순하며, 포유능력이 우수하고, 육질이 부드럽고 Oleic acid의 함량이 높아 여느 종들과 비교하였을 때 경쟁력을 가지고 있으나(이 등, 2008) 현재 토착종에 대한 품종 등록이 미비하고, 모색의 발현양상이 고정되지 않아 아직까지 주요 품종의 반열에 오르는데 비교적 어려움을 격고 있다. 우리나라의 소는 황모색종의 한우, 흑모색종의 흑우 그리고 호반모색을 가지는 칡소를 대표 종으로 여기고 있으며, 모색의 양상에 따라 갈모, 흑색, 백색, 반, 렴 및 잡모 등으로 분류하였으며, 이들의 분류는 현재 유전자원`의 다양성이 부각되면서 2004년 농림부에서 가축유전자원현황에 대한 국가 보고서에서 한우를 황색한 우, 흑색한우, 제주흑우, 칡한우로 분류하여 보고함으로써 다양한 한우의 유전자원보존에 단초를 마련하고 있다. 우리나라의 재래가축인 한우는 약 4천여 년 전 유럽우 계통과 인도 견봉우 계통이 교잡되어 중국대륙, 몽골, 만주 등을 거쳐 한반도에 전래되었다는 것이 정설로 되어 있으나(한, 1991), 토종 가축 유전자원의 미비로 정확 한 유래에 대한 예측만이 가능할 뿐이다. 1920년 요시다(吉田雄次郞)의 조선농회보에 기록된 한반도 소의 모색 분포 조사 보고에 따르면 8,051두의 모색의 분포가 갈모 66.69%, 흑색 11.72%, 백색 1.33%, 호반모 6.06% 그리고 기타잡모 14.17%로 존재했음을 알 수 있으며, 한반도 한우의 모색에 따른 고유 유전자원 확보에 대한 단서로 볼 수 있다. 특히 소의 품종 고정 및 생물자원 확보측면에서 중요시 되고 있는 질적 형질인 모색의 양상 은 토종 가축을 결정짓는 중요한 요소라 할 수 있다. 가축의 모색 결정에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 유전적 경로로써 melanogenesis mechanism을 들 수 있으며, 이는 외부의 호르몬 상태에 따라 melanocyte 내 metabolism의 작용에 따라 phaeomelanin 와 eumelanin을 형성 시키는 것으로 알려져 있다 (Jackson, 1994). 특히 이 두 melanin 색소체의 경우 표피세포체에 영향을 주어 색의 변화에 역할 한다 (Slominski 등 2004; Selz 등 2007). 즉 모색의 결정에 관하여 세포 내 melanin합성 경로의 상호조절 관계는 매우 중요하며, 이에 따른 주요 인자의 변화는 품종간 특징을 구성하는 요소로써 작용한다(Lee 등,2007).

    지금까지 많은 연구를 통하여 척색동물의 모색 결정의 주요 단서로 melanogenesis와 연관된 많은 기전들에 대한 연구가 활성화되고 있으며, 그중 ɑ-MSH(Melanocyte stimulating hormone)와 결합하는 수용체 작용 및 변이에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 소에서 발현되는 melanocortin 1 receptor(MC1R) 유전자(Klungland 등, 1995; Joerg 등, 1996; Rouzaud 등, 2000)를 비롯하여 tyrosinase(TYR), tyrosinase- related protein(TRP-1), dopachrome tautomerase (DCT) 등 색소세포 내 melanin 합성에 관여하는 유전자(Guibert 등, 2004; Wang and Hebert, 2006). 그리고 agouti 유전자(Giradot 등, 2005; Royo 등, 2005; Girardot 등, 2006) 등이 염기서열 의 변이와 모색 발현의 연관성에 대한 연구가 진행되어 있는데, MC1R 유전자는 agouti유전자 좌위와 더불어 색소세포(melanocyte)의 두 가지 색소 생산의 조절인자의 역할을 함으로써 모색 발현을 결정하는 것으로 알려 져 있다(Jackson, 1993; Robbins 등 1993; Royo 등 2005). 나 등(1986)의 연구 결과에서 비경 세포에서 흑색 침착도에 따른 흑점비경의 출현에 따라 흑점 비경의 등급을 분류하고 있으며, MC1R의 변이 유전자형에 따라 비경흑색 및 황색 한우의 경우 E+/e와 e/e를 포함하고 있으나 E+형의 유전적 출현 빈도가 비경흑색의 경우 0.37 황색의 경우 0.11로 비경황색 한우의 allele 빈도가 높아 MC1R 유전자가 어느 정도 비경색에 영향을 주는 것으로 추정되어 있다(이 등, 2002; 박 등, 2012). 그러나 칡소의 경우 성장발달 추이에 따라 색의 변화가 감지되고 있으며, 이에 대한 호르몬 이상 및 변화의 연관성에 따른 연구 보고는 미비하다. 따라서 본 연구는 내분비 인자의 영향에 따른 melanin 생합성의 주요 경로에 대한 기초 연구(PG Bischitz BSc등,1959)를 바탕으 로 칡소의 melanocyte에 성 호르몬의 발현이 Melanogenesis mechanism에 미치는 영향을 분석하여 성호르몬 에 따른 melanin 조절에 대한 연관성을 분석하여 칡소 품종 결정에 대한 기초자료로 활용하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 공시 재료

    본 실험에서 사용된 칡소는 울릉군 농업기술센터에서 관리 및 사육 되고 있는 칡소를 Lee등(2011)의 분류 방법에 따라 호반우, 염우, 황우로 분류한 후 (Fig 1) 귀의 표피조직을 채취하였고, 초대배양을 통해 피부세포 를 재추출하여 공시하였다.

    2. Cell Treatment Culture

    6 well plate의 각 well 당 3x104 cell을 접종하고 호르몬을 첨가하지 않은 Negative 그룹, Estrogen 5IU 첨가된 그룹 과 Testosterone 5IU 첨가된 그룹, 호반우, 염우, 황우의 세포 총 3×3 그룹을 72시간 동안 38℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 48시간과 72시간 경과 시 세포를 채취하였다(Table 1). 기본 배양배지는 15% FBS가 첨가된 DMEM을 사용하였다.

    3. 배지 ELISA 분석

    배양배지의 상층액 1㎖을 추출하여 1:1로 희석한 후 96well ELISA판에 120㎕씩 분주하고 antibody (MMP-2)를 분주하여 4℃에서 overnight 하였다. Washing buffer(1×PBS with 2.5%triton X-100)로 각 well을 세척하고 1% Skim milk blocking solution으로 4℃에서 24시간 동안 blocking하였다. 배양배지를 assay buffer에 희석하여 넣고 반응시킨 후 세척하여 detection antibody(MMP-2)를 넣고 반응시켰다. 세척한 후 substrate solution을 넣고 반응시켜, 2M H₂SO₄를 넣고 450nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.

    4. RNA추출 및 cDNA 합성

    RNA 추출은 98℃에서 3분간 열처리 한 후 4℃에서 2분간 냉각하여 cDNA합성 과정과 통합하여 실시하였 다. Total RNA에 Oligo dT primer로 annealing한 후 SuperScriptⅡ RT(50units, Invitrogen, USA)으로 First-strand cDNA를 합성하여 house keeping gene(18sr)로 정량하였다.

    5. cDNA 정량분석

    cDNA를 bos-GAPDH로 정량하기 위해 cDNA 1㎕에 10 x PCR buffer (MgCl2) 2.5㎕, 0.2mM dNTP Mixture(G&P,Kor) 2㎕, bos-GAPDH Fw primer, Rv primer를 각각 1㎕씩 첨가하여 최종 용량이 25㎕가 되 도록 한 후 PCR을 실시하였다. 1% agarose에서 100v 30분간 전기영동을 실시하고, UV상에서 관찰하여 100bp Ladder의 band를 기초로 하여 정량하였다.

    6. Real-Time PCR

    각 시료의 cDNA를 이용하여 0.2㎖ PCR stiptube에 cDNA 1㎕를 사용하였으며, 반응액으로는 SYBR Green Realtime PCR Master Mixture Mix(toyobo, Jap) 9㎕, 증류수 4㎕, Fw primer, Rv primer (Table 2)를 각각 1㎕를 첨가하여 최종 반응액을 16㎕로 맞춘 후 Termal Cycle 1cycle의 95℃에서 1min, 95℃ 10sec, 60℃에서 15sec, 72℃에서 20sec 40cycle을 수행하였다.

    7. Protein extraction

    각 시료를 PRO-PREPTM(Intronbiotechnology, USA.)을 400㎕를 혼합한 우 얼음 위에서 20분 동안 반응시 킨 후 13,000rpm(4℃)으로 원심 분리하여 상층액을 추출하여 –80℃ 보관하여 분석에 사용하였다.

    8. Western blot analysis

    칡소의 귀세포 내 melanocyte구간을 채취하여 세포 배양 후 약 3×105의 세포를 모아 추출한 단백질을 사용 하여 Melanogenesis의 주요 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 분석 방법은 먼저 각각의 total 단백질을 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE)로 분리한 다음, semidry electroblotter apparatus를 이 용하여 polyvinylidene difluoride (PVDF)membrane (0.2 um)에 transfer하였고, 전사된 membrane은 실온에서 한 시간 동안 3% skim milk blocking reagent로 bloking하였다. 1차 항체의 반응을 위해 table 3와 같은 antibody를 사용하여 4℃에서 over night하여 항원 항체 반응을 유도하였고, 이후 unbound antibody를 제거하 기 위해 TBS-T(1XTris+1XNacl+0.05% Tween 20)를 이용하여 10분간 3회 반복하여 세척하였다. 2차 항체의 반응을 위하여 secondary antibody linked to anti-rabbit을 실온에서 3시간 동안 반응시켰고, TBS-T를 사용하 여 10분간 3회에 걸쳐 세척하였다. 이 후, membrane은 2ml lumi-Light substrate solution으로 형광 발색하였 고 1∼5분 동안 X-ray film위에서 노출시켰다.

    9. 통계처리

    Real-time PCR의 실험적 통계학적 분석은 SAS package를 이용하였고, 분석 값은 mean±SD로 나타냈으며, 군 간의 유의성은 P<0.05 수준에서 검증하였다.

    결 과

    1. 호르몬첨가에 따른 세포활성화

    칡소의 피부세포가 호르몬의 적응하는 정도를 비교분석하기 위하여 세포 재구성에 영향을 주는 것으로 알려 진 기저막 분해효소 MMP-2의 활성도를 분석하였다. 기저질에 영향을 주는 MMP-2의 경우 negative에서 흑모 색의 세포(KDS)C를 제외한 호반모색의 세포(KBSC), 황모색의 세포(KYSC)에서 72시간 경과 시 MMP-2가 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다. Estrogen을 첨가한 그룹의 경우 흑모색의 세포(KDSC)와 황모색의 세포 (KYSC)의 MMP-2의 변화는 없었으나, testosterone 첨가 시 48시간에서 72시간까지 점차 증가하는 것을 확인 하였다.

    따라서 호반모색의 세포(KBSC)의 경우 호르몬의 첨가 유무에 상관없이 MMP-2의 반응이 72시간시 줄어드 는 것을 확인 할 수 있었으며, 그 외 세포들의 경우 testosterone의 첨가에 따라 MMP-2가 증가되어 기저질의 변화가 활발하게 이루어지는 것을 확인하였다. (Fig 2)

    2. 호르몬첨가에 따른 세포 내 Melanogenesis 관련 유전자 발현양상

    (1) 호르몬 미첨가군에 유전자 발현양상

    호르몬 미첨가시 각 세포 별 Melanogenesis 관련 인자의 발현양상을 비교한 결과, 황모색 세포(KYSC)와 흑모색의 세포(KDSC)의 경우, 48시간에서 72시간이 경과함에 따라 전체적으로 증가하는 발현양상을 보였으 나, 호반모색의 세포(KBSC)의 경우 48시간에 높게 발현되었던 주요인자들이 72시간 경과 시 현저하게 줄어드 는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 Melanogenesis에 직접적인 영향을 미치는 인자 중 TYRP1 과 DCT인자에서 는 48시간에서 72시간 경과 시 급격히 줄어드는 발현양상을 확인하였다(Fig 3).

    (2) Estrogen 호르몬 첨가군에 유전자 발현양상

    Estrogen을 첨가한 각 세포의 PT-PCR 분석 결과, 호반모색의 세포(KBSC)에서 MC1R의 발현정도가 흑모색 의 세포(KDSC)와 황모색의 세포(KYSC)에 비하여 현저히 낮은 양상을 보였으나, CREB1이 현저히 높은 양상 을 보였다. TYR 발현은 Estrogen 처리군 KYSC 72시간에서 가장 높은 발현 양상을 나타내었고, TYRP1과 DCT의 발현은 각각 호반모색의 세포(KBSC)의 72시간과 흑모색의 세포(KDSC)의 48시간 estrogen 처리군에 서 가장 높은 발현 양상을 나타냈다. 전체적으로estrogen을 첨가한 호반모색의 세포(KBSC)와 흑모색의 세포 (KDSC)의 melanogenesis인자들의 발현은 대부분 줄어드는 것을 확인하였고, 황모색의 세포(KYSC)에서는 큰 차이가 없는 것을 확인하였다(Fig 4).

    (3) Testosterone 호르몬 첨가군에 유전자 발현양상

    Testosterone을 첨가한 각 세포의 분석 결과, MC1R의 발현의 경우 호반모색의 세포(KBSC)에서는 72시간 이 경과함에 따라 증가하는 양상을 보였고, 흑모색의 세포(KDSC)와 황모색의 세포(KYSC)에서는 감소하는 양상을 보였다. TYR , TYRP1, DCT 발현의 경우 호반모색의 세포(KBSC)에서 48시간에는 가장 낮은 발현 양상을 나타내다가 72시간에는 증가하여 가장 높은 발현양상을 보였다. 하지만 흑모색의 세포(KDSC)와 황모 색의 세포(KYSC)는 48시간에서 72시간이 경과함에 따라 감소하는 양상을 보였다. 즉, 호반모색의 세포 (KBSC)에서 Melano- genesis 관련 인자들의 발현은 증가하는 것을 확인하였고, 흑모색의 세포(KDSC)와 황모 색의 세포(KYSC)에서는 발현이 줄어드는 것을 확인 하였다(Fig 5).

    3. 호르몬첨가에 따른 세포 내 Melanogenesis 관련 단백질 발현양상

    호르몬 첨가에 따른 MC1R 단백질의 활성 및 발현양상을 분석한 결과 Fig 6과 같다. 호르몬이 첨가되지 않은 군의 경우 표피세포 내 MC1R 단백질의 활성은 세포 배양시간에 따라 변화가 미약 하였으며, estrogen 첨가군의 경우 호반모색 및 황모색에서 48시간에 비하여 72시간의 MC1R 발현이 높아지는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 흑모색의 경우 최초 48시간에서 높은 발현을 보였으나, 72시간 경과시 다소 낮게 발현되었음을 확인 하였다. testosterone의 경우 MC1R의 변화가 호반모색에서 급진적으로 발현하였으며, 흑모색 및 황모색 에서 점차 낮아졌다.

    고 찰

    현재까지 연구 보고된 칡소의 모색 분포를 보면 울릉도의 경우 호반모색을 비롯한 흑모색, 황모색의 출현이 전체적으로 63%, 24% 그리고 13%로 발현되고 있는 것으로 알려져 있다(이 등 2011). 즉 칡소의 품종을 결정하는 요소로 호반모색을 들 수 있는데, 이는 다시 색의 농도 및 비경색의 유무에 따라 총 7가지의 양상을 보이는 것으로 연구되어지고 있다. 즉 이와 같은 다양한 모색의 결정은 지금까지 알려진 바로 melanogenesis의 변화 및 MC1R의 자연 혹은 인위적 작용에 따라 모색의 강약 혹은 변이를 형성하는 것으로 볼 수 있으며, 유전적 변이과정이 후대 모색 결정에 중요한 작용을 할 것이라고 사료되어 왔다(Klungland 등 1995). 소에서 발현되는 MC1R은 표현형의 양상별로 1, 2, 3의 family군이 각각 작용하는 것으로 사료되어 지는데 그중 MC1R의 변이는 가장 중요한 결정요소로 볼 수 있다(Klungland 등, 1995; Adalsteinsson 등, 1995). 소의 MC1R 유전자에는 3개의 대립유전자(ED, E+, e)가 존재하는데, 이들의 양상은 Homozygote 혹은 Heterozygote에 따라 a-MSH의 수용체 결합에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Chung 등, 2000; Lee 등 2009). 또한 이들의 변이는 Melanogenesis를 형성하는 시점에서 최종 melanin형성인자인 TYR, TYRP1 그리고 DCT의 작용에 역할 하는 것으로 볼 수 있다. 그러나 이런 MC1R의 변이는 선천적 혹은 후천적 변이에 따라 나타나게 되는데, melanin형성에 중요한 역할을 하는 호르몬의 관계가 Melanin 효소의 최종 산물에 역할을 할 것이라 사료되어진다(Agar 등 2005).

    본 연구에서 수행된 실험은 성호르몬의 변화가 칡소의 melanocyte에 작용하였을 때 각각의 melanogenesis mechanism에 영향하는지에 대하여 분석하였다. 먼저 호르몬의 영향이 like-melanocyte 활성에 작용하는지에 대한 분석으로 김 등(2014)의 연구과 같이 소에서도 세포 활성 및 사멸에 영향을 줄 수 있음을 확인 하였고, 특히 testosterone 첨가가 세포외기저막을 분해하는 MMP-2의 작용에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 특히 호반모색의 세포(KBSC)에서 의 경우 다른 모색에 비하여 MMP-2의 발현이 현저하게 낮아지는 것을 확인하였고 이는 성호르몬의 양상에 따라 세포의 활성이 달라지는 것을 알 수 있다(김 등 2014). 성호르몬의 종류에 따라 Melanogenesis 관련 인자들의 발현양상을 비교분석한 결과 Estrogen의 경우 MC1R의 발현이 황모색을 제외한 흑모색, 호반모색에서 높게 발현되는 양상을 보였으며, melanin 합성을 유도하는 TYR, DCT의 경우도 비슷한 양상을 보였다. 그러나 흑모색과 호반모색 사이의 유전자 발현양상을 비교하였을 때 흑모색에서의 발현이 현저하게 높아졌음을 확인 하였다. Testosterone의 경우 MC1R 및 melanogenesis 연관 유전자들의 발현이 호반모색 세포에서 급진적으로 높아짐을 확인 하였으며, 특히 tyrosine의 활성에 영향을 미치는 TYR, DCT의 발현이 높아지는 것을 확인 할 수 있었다. 즉 Estrogen의 작용은 호반모색에서 세포의 기저질 분해 작용에 큰 영향을 주지는 못하였으며, Melanin 색소 활성에 미치는 유전자들의 발현이 억제되는 것으로 볼 수 있고, 이에 비하여 testosterone의 경우 세포활성에 영향을 주는 MMP-2의 발현을 억제시켜 세포의 활성을 높이는 것으로 사료될 수 있다. 즉 MMP-2의 작용이 줄어드는 호반모색의 세포에서 MC1R의 발현이 현저하게 높음으로써 세포분열과 멜라닌 생성을 촉진 시킬 수 있다는 연구결과와 같은 양상을 보이고 있다(Vage 등 1999; Klunglands 등 1995). 단백질 활성도를 분석한 결과에서도 testosterone 첨가군에서 MC1R의 활성이 급격하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 즉 호반모색 세포의 경우 testosterone의 작용이 높아질수록 호반모색 및 흑모색의 증가를 초래할 수 있다는 이 등 2015의 연구결과와 같았으며, estrogen의 작용은 반대로 황모색에서 세포활성 및 melanogenesis 관련 유전자의 저해를 초래할 수 있을 것이라 판단된다. 따라서 본 연구 결과를 토대로 칡소의 호반모색 발현은 testosterone의 증가가 ACTH 및 MC1R의 활성을 극대화 해주는 전구물질체라 말할 수 있으며, 이는 모색 발현에 영향을 줄 수 있을 것이라 본다. 이 등 2015의 연구결과에서 언급한 칡소의 송아지와 성축에서 testosterone의 증가양상과 모색과 깊은 연관성을 지닌다는 결과와 같이 본 연구 결과에서 testosterone은 melanocyte세포층에 영향을 주어 세포의 활성 및 melanogenesis mechanism에 중요한 영향을 미칠 것이라 사료된다. 따라서 본 연구결과를 통하여 성호르몬의 작용이 melanin색소 형성에 결정적인 영향을 줄 것이라 표현하기는 어려우나 melanogenesis 관련 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있을 것이라 사료된다.

    결 론

    칡소의 모색별 성호르몬의 역할이 melanogenesis 관련 유전자에 미치는 영향을 분석하기 위하여 황모색, 흑모색 그리고 호반모색의 표피세포에서 melanocyte가 분포되어 있는 구간을 채취하여 estrogen 과 testosterone를 첨가하여 배양 하여 72시간 동안 세포활성 및 melanin 유전자들의 발현양상을 분석 하였다. 분석 결과 estrogen의 경우 황모색을 제외한 다른 모색군에서 melanin관련 유전자들이 점차 낮은 발현을 보였으며, 특히 호반모색의 세포에서는 세포활성의 저하 및 관련 유전자들의 발현이 현저하게 낮아졌다. 그러나 testosterone의 경우 세포활성은 저해하는 MMP-2의 발현이 낮았으며, melanin관련 유전자의 발현이 점차 증가하는 추이를 보였는데 이는 estrogen에 비하여 testosterone이 호반모색 표피세포층에 영향을 주는 것으로 사료될 수 있다. 즉 본 실험으로 testosterone의 작용이 표피세포 층에 위치한 melanocyte의 활성을 극대화 시켜 melanin 유전자들의 발현을 자극하는 것으로 사료될 수 있으며, 모색을 결정하는 요인으로 사료될 수 있다. 특히 MC1R의 활성이 극대화되는 호반모색의 세포는 estrogen과 testosterone의 상호보완적인 작용을 통하여 호반모색의 양상이 표현되는 것으로 볼 수 있으며, melanin발현에 관련된 연구들과 상호보완하면 모색 발현의 기전을 잘 설명하고, 칡소 모색 결정에 관련하여 호반모 출현 비율을 향상 시킬 수 있는 기초자료로써 매우 중요할 것이라 사료된다.

    Figure

    JET-33-107_F1.gif

    Criteria for classification on the Korean Brindle Cattle coat color.

    JET-33-107_F2.gif

    Analysis of MMP-2 expression by ELISA (KBSC: Korean Brindle Cattle Skin Cell).

    JET-33-107_F3.gif

    Expression of Melanogenesis-related Genes by Real-time PCR (Negative).

    JET-33-107_F4.gif

    Expression of Melanogenesis-related Genes by Real-time PCR (Estrogen).

    JET-33-107_F5.gif

    Expression of Melanogenesis-related Genes by Real-time PCR (Testosterone).

    JET-33-107_F6.gif

    Analysis of protein detection. [A : b-actin detection, B : MC1R detection, C : MC1R protein level (Image J program)].

    Table

    Hormone treatment culture of cell

    Primers for real-time PT-PCR analysis

    Antibody list for western blot analysis

    Reference

    1. AgarN and YoungAR . 2005. Melanogenesis: a photoprotective response to DNA damage? . Mutation Research571:121-132.
    2. BischitzPG and SnellRS . 1959. The Effect of Testosterone on the Melanocytes and Melanin in the Skin of the Intact and Orchidectomised Male Guinea-Pig . The Journal of Investigative Dermatology33:299-306.
    3. ChungER , KimWT , KimYS and HanSK . 2000. Identification of Hanwoo meat using PCR-RFLP of MC1R gene associated with bovine coat color . Kor. J. Anim. Sci. Technol.42:379-390.
    4. CostinGE and HearingVJ . 2007. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress . FASEB J.21:976-994.
    5. DengWD , ShuW , YangSL , ShiXW and MaoHM . 2009. Pigmentation in Black-boned sheep (Ovis aries): association with polymorphism of the MC1R gene . Mol. Biol. Rep.36:431-436.
    6. GiradotM , MartinJ , GuibertS , LevezielH , JulienR and OulmoudenA . 2005. Widespread expression of the bovine Agouti gene results from at least three alternative promoters . Pigment Cell Res.18:31-41.
    7. GirardotM , GuibertS , LaforetM-P , GallardY , LarroqueH and OulmoudenA . 2006. The insertion of a full-length Bos taurus LINE element is responsible for a transcriptional deregulation of the Normanne Agouti gene . Pigment Cell Research19:346-355.
    8. GuibertS , GirardotM , LevezielH , JulienR and OulmoudenA . 2004. Pheomelanin coat colour dilution in French cattle breeds is not correlated with the TYR, TYRP1 and DCT transcription levels . Pigment Cell Res.17:337-345.
    9. ItoS , WakamatsuK and OzekiH . 2000. Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis . Pigment Cell Res.13Suppl. 8:103-109.
    10. JacksonIJ . 1993. Colour-coded switches . Nature362:589-589.
    11. JacksonIJ . 1994. Molecular and developmental genetics of mouse coat color . Annu. Rev. Genet.28:189-217.
    12. JoergH , FriesHR , MeiferinkE and StranzingerGF . 1996. Red coat color in Holstein cattle is associated with a deletion in the MSHR gene . Mamm. Genome7:317-318.
    13. KimSH , HwangSY and YoonJT . 2014. Microarray-Based Analysis of the Differntial Expression of Melanin Synthesis Genes in Dark and Light-Muzzle Korean Cattle . PLOS ONE9:e96453.
    14. KlunglandH , VageDI , Gomez-RayaL , AdalsteinssonS and LienS . 1995. The role of melanocyte-stimulating hormone (MSH) receptor in bovine coat color determination . Mamm. Genome6:636-639.
    15. ParrishJA , JaenickeKF and AndersonRR . 1982. Erythema And Melanogenesis Action Spectra Of Normal Human Skin . Photochemistry and Photobiology36:187-191.
    16. RobbinsLS , NadeauJH , JohnsonKR , KellyMA , Roselli-RehfussL , BaackE , MountjoyKG and ConeRD . 1993. Pigmentation phenotypes of variant extension locus alleles result from point mutations that alter MSH receptor function . Cell72:827-834.
    17. RouzaudF , MartinJ , GalletPF , DelourmeD , Goulemot-LegerV , AmiguesY , MenissierF , LevezielH , JulienR and OulmoudenA . 2000. A first genotyping assay of french cattle breeds based on a new allele of the extension gene encoding the melanocortin-1 receptor (MC1R) . Genet. Sel. Evol.32:511-520.
    18. RoyoLJ , AlvarezI , FernandezI , ArranzJJ , GomezE and GoyacheF . 2005. The coding sequence of the ASIP gene is identical in nine wild-type coloured cattle breeds . J. Anim. Breed Genet.122:357-360.
    19. SelzY , BraaschI , HoffmannC , SchmidtC , SchultheisC , SchartlM and VolffJN . 2007. Evolution of melanocortin receptors in teleost fish : the melanocortin type 1 receptor . Gene401:114-122.
    20. ShenT , HeoSI and WangMH . 2012. Involvement of the p38 MAPK and ERK signaling pathway in the anti-melanogenic effect of methyl 3,5-dicaffeoyl quinate in B16F10 mouse melanoma cells . Chem. Biol. Interact.199:106-111.
    21. SlominskiA , TobinDJ , ShibaharaS and WortsmanJ . 2004. Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal . Regulation Physiol. Rev.84:1155-1228.
    22. VageDI , KlunglandH , LuD and ConeRD . 1999. Molecular and pharmacological characterization of dominant black coat color in sheep . Mamm. Genome10:39-43.
    23. WangN and HebertDN . 2006. Tyrosinase maturation through the mammalian secretory pathway: bringing color to life . Pigment Cell Res.19:3-18.
    24. ZhouJ , ShangJ , PingF and ZhaoG . 2012. Alcohol extract from Vernonia anthelmintica (L) willd seed enhances melanin synthesis through activation of the p38 MAPK signaling pathway in B16F10 cells and primary melanocyte . J. Ethnopharmacol.143:639-647.
    25. 이호준 홍연식, 이경태, 김상환, 정덕원, 정경섭, 김경래, 민관식, 윤종택. 2008. 칡소 수정란 이식 한우의 임신기간, 생시체중 및 모색발 현 양상 조사. 한국수정란이식학회지 23:69..
    26. 한상기 정의룡, 양교석, 신유철. 1991. 한우개량을 위한 유단백질의 유전적 다형현상에 관한 연구. 한국축산학회지 33:111-120.