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ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.33 No.3 pp.129-137
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2018.33.3.129

Development of aortic endothelial cells to express CD37 and CD73 isolated from alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out and MCP expressing pig

Jin-Gu No, Sung-June Byun, Hyeon Yang, Sun A Ock, Jae-Seok Woo, Hwi-Cheul Lee, In-sul Hwang, Ji-Youn Kim, Sang Hyoun Park, Joo Young Lee, Keon Bong Oh†
Animal Biotechnology Division, National Institute of Animal Science, RDA, 1500, Kongwipatjwi-ro, Wanju-gun, Jeollabuk-do, 55365, Korea
Correspondence: Keon Bong Oh Phone: +82-63-238-7254, Fax: +82-63-238-7247 E-mail: keonoh@korea.kr
23/08/2018 17/09/2018 27/09/2018

Abstract


Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig (GalT-MCP/-MCP). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from GalT-MCP/-MCP pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.



alpha 1,3-galactosyltransferase 기능 제거 및 MCP 발현 형질전환 돼지의 대동맥 혈관내피세포에 CD37/CD73 발현 세포주 개발

노 진구, 변 승준, 양 현, 옥 선아, 우 제석, 이 휘철, 황 인설, 김 지윤, 박 상현, 이 주영, 오 건봉†
농촌진흥청 국립축산과학원 동물바이오공학과, 전라북도 완주군 이서면 콩쥐팥쥐로 1500, 55365

초록


    서 론

    이종이식은 장기의 질병을 더 이상 약물 혹은 방사선 치료 등과 같은 방법으로 환자를 치료할 수 없는 경우 사용할 수 있는 최후의 수단이다. 그러나, 공급에 비해 필요한 장기의 수가 전세계적으로 급증하면서 이를 극복하기 위해 돼지의 장기를 유인원에게 이식하기 위한 연구가 진행되었다 (Lexer 등, 1986; Cooper 등, 1988). 일반 돼지의 장기를 유인원에 이식하게 되면 초급성 면역거부반응 (Hyperacute rejection, HAR)이 일어나게 되며, 그 결과로 혈전형성, 간질 출혈, 부종 등과 같은 비정상적인 작용으로 인해 이식된 장기 의 괴사를 초래하게 된다 (Cooper 등 2016). 이후, 여러 연구자들에 의해 초급성 면역거부반응의 원인 유전자인 alpha 1,3-galactosyltransferase (GalT) 기능이 제거된 돼지가 생산되었고(Dai 등, 2002; Phelps 등, 2003; Kolber-Simonds 등, 2004), 이 돼 지의 심장을 영장류에 이식 하였을 때, 생존기간이 2~6개월로 크게 증가되었다고 보고 되었다 (Kuwaki 등, 2005; Tseng 등, 2005). 그런데, 사망한 영장류의 사망원인을 분석한 결과 초급성 면역반응은 확인되지 않았으나, 혈전성미소혈관증 (thrombotic microangiopathy), 이식 동맥병증 (graft arteriopathy)와 같은 혈관성 면역거부반응이 사망원인이라고 보고 하였다 (Buhler 등, 2001; Houser 등, 2004).

    영장류에 이식된 돼지의 장기에서 혈관성 거부반응이 일어나는 주요 원인중의 하나는 원숭이에 존재하는 항체와 이식된 돼지 장기의 혈관 내에 존재하는 항원이 혈관내피세포에 지속적으로 결합하면 보체 활성화가 진행되고, 이로 인해 혈관내피조직이 손상되어 생성되 는 혈전이라고 알려져 있다 (van Denderen 등, 1997; Lin 등, 1998; Gollackner 등, 2004). 또한, 돼지의 항 혈액응고 효소와 영장류의 혈액응고인자 사이의 분자적 불일치에 의해서도 혈관성 거부반응이 촉발되며 (Siegel 등, 1997; Kopp 등, 1997), 이는 결국 미소혈관증 이라는 병변으로 나타나게 된다 (Ierino 등, 1998). 혈액에 존재하는 adenosine triphosphate (ATP) 및 adenosine diphosphate (ADP)와 같은 뉴클레오타이드는 혈관내피세포 표면에 존재하는 CD39와 CD73에 의해 순차적으로 adenosine monophosphate (AMP), 아데노신 으로 각각 분해되는데, 아데노신은 혈전형성 및 염증반응을 조절하는 중요한 신호 전달 인자로 알려져 있다 (Hasko 등, 2008). 실제로 사람 CD39를 과 발현하는 생쥐를 이종간 장기 이식을 수행한 연구에서 거부반응이 억제되었다고 보고 되었고 (Dwyer 등, 2004). CD73 또한 마우스를 이용한 심장 이식 연구에서 이식 후 혈전생성, 염증반응과 같은 반응이 억제되었다고 보고되었다 (Koszalka 등, 2004; Hasegawa 등, 2008; Grunewald 등, 2010). 따라서, 혈전형성을 조절하는 인자인 아데노신의 대사에 중요하게 작용하는 CD39와 CD73의 과 발현을 통해 혈중 아데노신의 형성을 증가시킬 수 있다면, 혈관성 면역 거부반응을 억제시킬 수 있는 효과적인 방법이 될 수 있을 것이다.

    본 연구에서는 혈관내피세포에 특이적으로 발현하는 돼지의 intercellular adhesion molecule2 (Icam2) 프로모터에 CD39와 CD73을 연결한 벡터 pIcam2-hCD39/hCD73을 구축하였다. 이 벡터를 GalT 유전자 좌위에 membrane cofactor protein (MCP) 발현벡터가 도입 된 동형접합 형질전환 GalT-MCP/-MCP 돼지의 대동맥에서 분리한 혈관내피세포에 도입하여 CD39와 CD73를 발현하는 GalT-MCP/-MCP/CD39/CD73 세포를 생산하였다. 상기 세포는 혈관성 거부 반응의 기전을 분석하기 위한 재료와 형질전환 돼지의 생산을 위한 공여세포로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

    재료 및 방법

    1. 사람 CD39 및 CD73 동시발현 벡터의 제작

    사람 CD39 및 CD73 cDNA는 21C Frontier Human Gene Bank (Korea, Clone ID, Hmu001092)에서 구입한 클론과 돼지 teschovirus-1 2A (2A) 염기서열을 활용하여 합성하였다(Invitrogen, CA, USA). 돼지의 Icam-2 프로모터 정보는 이전의 연구에서 상세 하게 기술하였다(Jang 등, 2010). 합성된 CD39/CD73 cDNA를 pcDNA3.1 hygro 벡터의 Not I과 Xho I 인식 염기서열에 연결 시켜 pCMV-CD39/CD73 벡터를 완성하였다. 완성된 벡터를 제한효소 Nru I과 Hind III로 절단한 후 CMV 프로모터를 제거하였다. 그러고 나서 Icam-2 프로모터를 Nru I과 Hind III 인식 염기서열에 연결시켜 pIcam2-CD39/CD73 벡터를 완성하였다

    2. 세포의 분리 및 배양

    4주령 미니돼지의 대동맥을 채취한 후 절개한 대동맥의 내벽을 0.2% (v/v) collagenase type I (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가 된 6 well 플레이트에 부착시킨 후 37℃에서 3시간 동안 배양시켰다. 혈관 내벽으로부터 분리된 세포를 회수하여 0.1% 젤라틴으로 코팅 된 6 well 플레이트로 옮겨, endothelial growth medium-2 (EGM-2; Lonza, Koln, Germany) SingleQuots가 포함된 endothelial basal medium-2 (EBM-2) (Lonza) 배양액으로 37℃에서 배양하였다. 돼지 귀 섬유아세포의 분리 및 배양은 이전에 기술한 방법 (Ko 등, 2013)을 사용하였으며, 배양액은 15% fetal bovine serum (Invitrogen, CA, USA), 1% non-essential amino acids (Invitrogen), 0.1mM b-mercaptoethanol (Sigma), 1% antibiotic/antimcotic (Invitrogen) 및 0.1x Low serum growth supplement (Invitrogen)가 첨가된 DMEM-GlutaMAXTM (Invitrogen)를 사용하였다. 사람 혈관내피세포는 돼지 혈관내피세포와 동일한 배양액을 사용하여 배양하였다.

    3. 면역 염색 (Immuno-fluorescence assay)

    돼지의 대동맥으로부터 분리한 세포, 돼지 귀 섬유아세포 및 사람 혈관내피세포는 면역 염색을 위해 0.1% 젤라틴이 코팅 된 cover slip 위에서 3일간 배양하였다. 배양시킨 세포는 PBS를 이용하여 세 번 세척 한 후, 4% paraformaldehyde로 상온에서 30분간 고정시키 고 다시 세 번 세척하였다. Permeablilization은 permeabilization solution (0.2% Triton X-100)을 이용하여 상온에서 20분간 실시하였 다. 세 번 세척 후, 4% BSA가 들어있는 PBS로 상온에서 30분간 방치 하였다. anti-vWF (abcam, Cambridge, MA, USA)는 1: 100의 비율로 상온에서 1시간 반응시켰다. goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)은 1: 100 의 비율로 상온에서 30분동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포는 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 들어있는 Vecta-shield Mounting Solution (Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 핵을 염색하였다. vWF의 발현은 Leica DMI 6000B 역상 현미경 (Leica microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

    4. 관 형성 분석 (Tube formation assay)

    관 형성 분석을 위해, Growth factor-reduced BD Matrigel (BD biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)로 코팅한 96 well 플레이트 에 돼지 혈관내피세포, 귀 섬유아세포 및 사람 혈관내피세포를 1105 농도로 분주하였다. 분주한 세포는 endothelial growth medium-2 (EGM-2) SingleQuots가 포함된 endothelial basal medium-2 (EBM-2)에서 4시간 동안 배양한 후, Leica DMI 6000B 역상현미경으로 형태를 관찰하였다.

    5. 세포에 유전자 도입

    돼지 혈관내피세포에 발현벡터를 도입하기 위한 방법은 이전의 연구에서 자세히 기술하였다 (Ko 등, 2013). primary mammalian endothelial cells, Amaxa® Basic Nucleofector® kit (Lonza)를 이용하여 장치에 내장 되어 있는 M-003, U-023, W-023 및 Y-022 프로 그램으로 Nucleofection을 실시하였다. 돼지 혈관내피세포에 효과적인 유전자 도입 방법을 선별하기 위해, GFP 발현벡터를 상기 네 종류의 프로그램으로 발현벡터를 도입한 후, 세포 생존율 및 유전자 도입 효율은 유세포 분석기 (BD FACSvatageTMSE)를 이용하여 분석하였고, Leica DMI 6000B 역상현미경으로 녹색 형광 단백질 발현을 재확인 하였다.

    6. 유세포 (Flow cytometry) 분석

    유전자 도입 후, 배양시킨 세포는 마그네슘과 칼슘 이온이 포함되어 있지 않은 Hank’s balanced salt solution (HBSS)를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 세포는 배양접시로부터 분리 및 단일세포로 만들기 위해 emzyme-free cell dissociation solution (EMD Millipore Corporation, MA, USA)를 직접 배양접시에 처리하였다. 분리시킨 세포를 원심분리기를 이용하여 PBS로 3회 세척하였고, PE가 결합된 사람 CD39 및 CD73 항체 (BioLegend, CA, USA)를 포함하는 PBS 용액에 각각 부유시킨 후, 0℃에서 1시간동안 반응시 켰다. 항체 반응이 끝난 세포는 PBS로 다시 3회 세척한 후, 유세포 분석기 (BD FACSvatageTMSE, Germary)를 이용하여 CD39 및 CD73의 발현량을 분석하였다.

    7. 통계 분석 (Statistical analysis)

    통계 분석은 IBM SPSS virsion 19 (IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. GFP 발현 벡터 도입 후, 세포 생존율은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 방법을 이용하여 비교하였으며, 사후 검정은 Turkey 방법을 이용하여 분석하였다. P 값이 0.05 미만일 때 실험군 간의 차이가 있다고 판단하였다.

    결과 및 고찰

    돼지의 장기를 영장류에 이식하면 혈관에서부터 거부반응이 시작되므로 거부반응의 생화학적 분석을 위한 재료로서 돼지의 혈관내 피세포 개발이 요구되고 있으며, 생명공학 기술의 발달로 혈관 특이적으로 유전자를 발현하는 형질전환 돼지를 개발하기 위한 공여세포 로 활용도 가능하다고 판단된다. 이전의 연구에서 본 연구진은 GalT 유전자에 MCP 발현 벡터가 도입된 형질전환 GalT-MCP/-MCP 돼지를 개발하였다 (이 등, 2017). 본 연구는 상기 유전자형의 돼지 대동맥에서 혈관내피세포를 분리 한 후 배양하여 유전자 도입 방법을 확립 하고, 혈관성 거부반응의 억제 인자로 잘 알려진 CD39와 CD73 동시 발현 벡터가 도입된 세포를 제작하였다.

    재료 및 방법에서 서술한 것처럼 4주령의 GalT-MCP/-MCP 돼지의 대동맥을 채취한 후 혈관내피세포를 분리하여 배양을 실시하였다. 일반적으로, 혈관내피세포는 VEGF-A/VEGFR2 등과 같이 다양한 신생혈관 생성 신호에 반응하여 세포 이동을 통해 혈관형성에 관여 하며, 체외에서는 특정 배양 조건하에서 모세혈관과 유사한 형태로 바뀌는 특성을 가진다고 알려져 있다 (Laurent 등, 2007; DeCicco-Skinner 등, 2014). 상기 특성을 활용하여 관 형성 분석을 통해 분리된 세포가 혈관내피세포인지 확인 하고자 하였다. 그 결과, 사람 유래 혈관내피세포 HEAC와 마찬가지로 본 연구에서 분리한 세포는 모세혈관과 유사한 형태를 형성하는 반면에 섬유아세포에서 는 형성되지 않아 혈관내피세포의 특성을 보유한 세포임을 확인하였다 (Fig 1). 혈관내피세포 표지인자로 활용되고 있는 vWF (Hewett and Murray, 1993; Zanetta 등, 2000)의 발현을 면역 염색 방법을 분석한 결과 이전에 보고된 연구 결과와 (Jocelyne 등, 2000; Annette 등, 2002) 유사하게 vWF의 발현을 확인하였다(Fig 2). 반면에 대조군으로 사용한 돼지 귀 섬유아세포에서는 발현이 확인되지 않아 본 연구에서 분리한 세포가 대동맥 유래 혈관내피세포임을 확인하였다.

    조직에서 분리한 초기세포에 유전자를 도입하는 효율이 매우 낮은 것은 잘 알려져 있다. 이 전의 연구에서 본 연구진은 돼지의 섬유 아세포에 nucleofection 방법을 사용하여 효율이 매우 우수한 유전자 도입 방법을 확립한 바 있다 (Ko 등, 2013). 이에 본 연구에서도 혈관내피세포에 효과적인 nucleofection 방법을 확립하고자 U-023을 포함하여, M-003, W-023, Y-022의 4가지 프로그램을 이용하여 GFP 유전자를 도입한 후 세포 생존율 및 유전자 발현율을 분석하였다. FACS 분석을 통해 GFP 도입 효율과 생존율을 분석한 결과, U-023, W-023, Y-022의 세 가지 프로그램이 M-003 프로그램에 비해 높은 유전자 도입 효율을 나타냈으나, Y-022 프로그램의 경우 세포 생존율이 다른 두 가지의 프로그램에 비해 현저하게 낮게 나타났으며 (Fig 3A), 면역 염색을 통해 재 검증한 결과에서도 FACS 분석 결과와 유사한 결과를 얻었다 (Fig 3B). 이상의 결과를 통해, nucleofection 방법을 이용하여 돼지의 혈관내피세포에 외래 유전자 를 도입시킬 경우, U-023 또는 W-023 nucleofection 프로그램이 적합하다고 판단된다. 그러나, 다양한 유전자 도입 방법이 존재하고 세포의 종류에 따른 도입 효율도 상이하기 때문에 (Kim and Eberwine, 2010), 돼지에서 분리한 혈관내피세포에 유전자 도입에 대한 방법론적인 추가 연구도 필요하다고 생각된다.

    CD39 및 CD73은 ATP, ADP 그리고 AMP를 아데노신으로 분해시키는 기전을 통해 체내의 다양한 면역 반응을 조절한다고 알려져 있다 (Beavis 등, 2012). CD39는 비장, 흉선, 폐, 태반과 같은 혈관 내피세포 및 면역 세포가 다량 존재하는 조직에서 발현 된다 (Enjyoji et al, 1999; Mizumoto 등, 2002). 또한, 대장암, 췌장암, 만성 백혈병 등과 같은 암 조직 및 세포에서 과 발현 되어 암세포의 성장을 촉진시키며 (Bstid 등, 2012), 사람과 설취류의 혈액에서는 활성화된 형태로 존재한다고 보고되고 있다 (Yegutkin 등, 2012). CD73은 뇌, 신장, 간, 폐, 심장 등과 같은 다양한 조직에서 발현되며 (Thompson 등, 2004), 백혈구 및 혈관 내피 조직에서도 발현 된다고 알려져 있다 (Lennon 등, 1998). 또한 다양한 암 조직에서 과 발현 되어 종양형성을 유도한다고 알려져 있다 (Beavis 등, 2012). CD39와 CD73은 이종이식 거부반응의 주요 요인인 혈전 형성 억제 효과를 기대할 수 있으나, 다양한 조직에서 과 발현 되어 종양을 형성을 유도하기 때문에, 본 연구에서는 CD39와 CD73을 혈관내피세포에서만 특이적으로 동시에 발현 시킬 수 있는 벡터를 제작하고 자 하였다. 혈관 내피세포에서만 표적 단백질을 발현 시킬 수 있다고 알려진 intercellular adhesion molecule 2 (Icam-2) 프로모터 (Jang 등, 2012)를 사용하여 CD39와 CD73을 동시에 발현하는 pIcam2-hCD39/hCD73 벡터를 구축하였다 (Fig 4A).

    실제로, 본 연구에서 구축한 pIcam2-hCD39/hCD73 벡터를 돼지 혈관내피세포에 도입하였을 때, CD39 및 CD73이 효과적으로 발현 되는지를 확인하기 위해, 유전자를 도입 후, FACS를 통해 CD39와 CD73의 발현을 확인하였다. CD39는 33.39%의 발현량을 보였으며, CD73은 26.81%의 발현량을 나타냈다 (fig 4B). 이와 같은 결과는, 본 연구에서 구축한 pIcam2-hCD39/hCD73 벡터가 성공적으로 돼 지 혈관내피세포에 도입될 수 있음을 보여주며, 돼지 Icam2 프로모터를 사용하였기 때문에 혈관내피세포에만 발현하는 다중 표적 유전 자의 발현이 가능하다는 것을 의미한다.

    일반적인 장기 이식에서는 장기 수여자가 가진 T 세포에 의한 면역 거부 반응이 주요 요인으로 고려되고 있으나 (Ingulli, 2010), 최근, 이종간 장기 이식의 경우 급성 면역 거부 반응에 대한 B 세포의 역할이 주목 받고 있다 (Dalloul, 2013). 실제로 B 세포에 의해 아데노신이 형성 되며, B 세포가 활성화된 T 세포를 억제시킨다는 연구 결과가 보고 된 바 있다 (Saze 등, 2013). 아데노신은 면역 반응을 조절하는 인자로 염증반응이 일어남에 따라 세포 주위의 농도가 급격히 증가한다. 다양한 원인으로 인해 손상되거나 괴사가 일어난 세포에서 ATP, ADP와 같은 뉴클레오타이드가 방출되고, 이는 ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase)라 고 불리는 외부 핵산분해효소인 CD39에 의해 AMP로 가수분해가 된다. AMP는 다시 CD73에 의해 아데노신으로 가수분해 되어 혈전 증, 염증, 면역 반응을 조절한다고 보고 되었다 (Deaglio and Robson, 2011). 실제로, CD39와 CD73이 결여된 마우스의 심장을 랫에 이식한 연구에서는 대조군에 비해 급격하게 면역거부반응이 일어남에 따라 이식 장기의 생존율 또한 급격히 감소한다고 보고되었고 (Enjyoji 등, 1999; Hasegawa 등, 2008), CD39를 과 발현 시킨 심장을 이식하였을 경우에는 혈전형성이 감소함과 동시에 이식 장기의 생존율이 증가한다고 보고하였다 (Imai 등, 2000). 또한, CD73이 결여된 마우스의 폐를 이식한 연구에서도 일주일 내에 심각한 염증반 응이 초래 된다고 보고되었다 (Ohtsuka 등, 2010). CD39와 CD73의 외부 핵산분해효소로서의 역할과 앞서 서술한 여러 연구 결과를 바탕으로, 본 연구에서 구축한 벡터를 이용하여 CD39와 CD73이 혈관내피세포에서만 과 발현 되는 형질전환 돼지의 생산을 통해, 초급 성 면역거부반응 이후의 혈관성 면역거부반응을 극복하는데 효과적일 것이라는 추정이 가능하다. 그러나, 본 연구에서 제작한 CD39/CD73 동시 발현 벡터를 이용하여 생산한 돼지의 장기를 원숭이에 이식하였을 때, 혈관성 면역거부반응을 실제로 억제할 수 있을 지에 관해서는 추가적인 이식 연구가 필요할 것이다.

    결론

    alpha 1,3-galactosyltransferase 의 기능이 제거된 형질전환 돼지의 생산을 통해, 이종간 장기 이식 시에 발생하는 초급성 면역거부반 응은 억제가 되었으나, 혈전 생성으로 대표되는 혈관성 면역거부반응이 문제가 되고 있다. 외부 핵산분해효소인 CD39와 CD73의 순차 적인 가수분해에 의한 최종 대사 산물인 아데노신은 혈전, 염증 및 면역 반응을 조절하는 조절자로서 작용한다. 따라서, CD39와 CD73 의 과 발현을 통해 혈관성 면역거부반응을 제어할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 혈관내피세포에서 특이적으로 작용하는 돼지 Icam2 프로모터에 사람 CD39와 CD73을 동시에 발현할 수 있는 pIcam2-hCD39/hCD73 벡터를 구축하였다. 또한 GalT-MCP/-MCP 형질전환 돼지의 대동맥으로부터 혈관내피세포를 분리 후 혈관내피세포임을 검증하였다. nucleofection 프로그램 W-023을 이용하여 벡터를 혈관 내피세포에 도입시킨 후, 유세포 분석 방법을 통해 CD39와 CD73이 각각 33.3% 그리고 26.8% 비율로 돼지 혈관내피세포에서 발현하 는 것을 확인하였다.

    사사

    본 연구는 농촌진흥청 연구사업 (세부 과제명: Thrombomodulin 유전자 발현 벡터 제작 및 세포주 구축, 세부과제번호: PJ01202201) 의 지원에 의해 이루어 진 것임

    Figure

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    Tube formation assay for angiogenesis on matrigel. Cells were plated onto polymerized Matrigel layer in a 96-well plate. Tube-like structure observed after 4h of incubation. A. Human aortic endothelial cells (HAEC). B. Porcine ear fibroblast cells (pEF). C. GalT-MCP/-MCP pAEC. Scale bar corresponds to 200 μm.

    JET-33-129_F2.gif

    Validation of endothelial cells isolated from GalT-MCP/-MCP pig using immunofluorescence analysis. Expression of an endothelial cell-specific marker vWF was shown in isolated endothelial cells (pAEC) as human aortic endothelial cells (HAEC) but not in ear fibroblasts (pEF). DAPI was used as nuclear counterstain. Scale bar corresponds to 100 μm.

    JET-33-129_F3.gif

    Porcine endothelial cells can be efficiently transfected by nucleofection. Pocine aortic endothelial cells were pulsed electrically with 4 different programs of nucleofection. A. Cell viability and efficiency were estimated using 3 independent experiments as detailed in Materials and Methods. B. Microscopy analysis of GFP expression. Letters means significant differences among each group (p<0.05).

    JET-33-129_F4.gif

    Efficient expression of CD39/CD73 in porcine endothelial cells. A. Structure of a construct designed for expressing CD39/CD73 specifically at endothelial cells. B. Flow cytometry analysis of CD39 and CD73 expression in GalT-MCP/-MCP pAEC. The figure shows binding of the antibody to CD39 and CD73 compared with that of the negative control (empty histograms).

    Table

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