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ISSN : 2508-755X(Print)
ISSN : 2288-0178(Online)
Journal of Embryo Transfer Vol.33 No.3 pp.177-183
DOI : https://doi.org/10.12750/JET.2018.33.3.177

Cytological analysis of pregnancy-associated plasma protein-A expression in porcine neonatal testis

Ji-youn Kim1, Keon Bong Oh1, Sung June Byun1, Sun-A Ock1, Hwi-Cheul Lee1, Hwang Seong-su1, SangHyun Park1, Wootae Ha2, Jae-Seok Woo1, Hyuk Song2
1Animal Biotechnology Division, National Institute of Animal Science, RDA, Wanju 55365, Republic of Korea
2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, KIT, Konkuk University, Republic of Korea
Correspondence: Jae-Seok Woo Phone: +82-63-238-7251, Fax: +82-63-238-7297 E-mail: jswoo631@korea.kr
04/09/2018 20/09/2018 22/09/2018

Abstract


The identification of biomarkers of a living tissues is essentially required to understand specific functions of the cells. In previous study, we reported IGFBP 3 as one of the putative biomarkers, by showing specific expression at porcine spermatogonial stem cells (SSCs) of early stage of porcine testis. In this study, we analyzed the expression of seven members of IGFBP family (IGFBPs) in SSCs and histological expression pattern of pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A), which plays a role on the growth promoting enzyme by cleavage of IGFBPs in testis of 5 days old pig. RT-PCR analysis showed that IGFBP 1, 2, 3, 4, and 6 were expressed at high level specifically in porcine SSCs compared with whole testis. We performed immunohisotochemical staining of testis sections with PAPP-A and protein gene product 9.5 (PGP9.5) which are the known biomarkers for SSCs. We were not able to find co-expression of PAPP-A and PGP9.5; PAPP-A was expressed only in Sertoli cells and PGP9.5 expression was confirmed in spermatogonium. Additionally, we were able to confirm the GATA4 expression in Sertoli and Leydig cells as a regulator of Sertoli cell function was not detected PGP9.5 expressing cells, indicating indirect evidence of that cytolocalization of PAPP-A expression is limited in Sertoli cells. These results suggested that the PAPP-A expressed in Sertoli cells may play role on regulation of development and differentiation of testicular cells through the IGF axis in neonatal porcine testis.



미성숙 돼지 정소에서 pregnancy-associated plasma protein-A의 발현의 세포학적 분석

김 지윤1, 오 건봉1, 변 승준1, 옥 선아1, 이 휘철1, 황 성수1, 박 상현1, 하 우태2, 우 제석1, 송 혁2
1농촌진흥청 국립축산과학원 동물바이오공학과
2건국대학교

초록


    Rural Development Administration
    PJ010944032018

    서 론

    생체조직의 특정 세포에서 특이적으로 발현하는 단백질 표지인자를 발굴하는 것은 세포의 특성과 기능을 구명하는데 있어서 매우 유용하다. 생식세포의 단계별 표지인자는 정자 형성 연구에 중요하며 설치류에서는 많이 확인되었지만, 돼지에서는 극히 일부만 보고 되었다Phillips 등 2010(). 정자는 세정관에 존재하는 정원줄기세포에서 생식 가능한 반수체 정자로 생성된다Aponte 등 2005(). 돼지의 미성숙된 정소에서 미분화 정원줄기세포의 표지 인자로서 protein gene product 9.5 (PGP9.5), promyelocytic leukemia zinc finger, Nanog, Oct4, stage-specific embryonic antigen-1 등이 알려져 있다Goel 등 2008Kim 등 2013Luo 등 2006(; ; ). 이전의 연구에서 total RNA sequencing 방법을 이용해 insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3)을 비롯하여 matrix metallopeptidase 1과 9, glutathione peroxidase 1 등의 유전자가 미분화 돼지 정원줄기세포에서 특이적으로 발현하며 표지인자로서 활용 가능성을 보고하였 다Lee 등 2016().

    Pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A)는 1974년 처음 발견된 단백질로 임신중 placental syncytiotrophoblast에 의하여 생성되고 임산부의 순환계로 분비되어 임신기간동안 농도가 증가한다Conover 2012Lin 등 1974(; ). PAPP-A는 임신초기 태아의 다운 증후군에 의해 감소되며 이를 통해 태아 다운증후군의 표지인자로 이용된다Wald 등 1999(). 또한, PAPP-A는 Insulin growth factor (IGF)의 활성인자로서 결합된 IGF/IGFBP-4를 세포의 Insulin growth factor 1 receptor (IGF1R)의 근접한 곳에서 IGFBP-4를 절단하 여 IGF와 IGF1R의 결합을 활성화시키는 기능을 가지고 있다Oxvig 2015().

    IGF system은 IGF-I, IGF-II, 각각에 대한 IGF receptor 그리고 6개의 IGFBP family로 구성되어 있다Jones와 Clemmons 1995(). IGF axis는 3개의 growth factor (IGF-I, IGF-II, insulin)와 상응하는 세포막 수용기인 IGF-1 receptor, IGF-II receptor, Insulin receptor로 구성된다Benyoucef 등 2007(). Insulin/IGF system은 세포의 성장, 증식, 분화 및 생존 조절에 중추적인 역할을 하며 신체의 거의 모든 조직과 system에 영향을 주며, 그 중에서도 정소의 발달과 기능에 중요한 역할을 한다Griffeth 등 2014(). 생식능력은 hypothalamic-pituitary-gonadal axis에 의해 조절되지만, Insulin/IGF system은 생식 기능을 조절한다Pitetti 등 2013Roth와 Amory 2011(; ). 또한 생쥐에서 insulin/IGF 신호전달은 성염색체 결정(sex determination)과 정소 분화에 결정적인 역할을 한다Peters 등 2003().

    본 연구는 5일령 돼지에서 IGX axis를 조절하는 IGFBPs와 PAPP-A가 정소, 정원줄기세포, sertoli 세포에서 발현되는 것을 분석하여 돼지 정소의 발달 및 향후 이루어질 정자 형성 과정의 기전 연구 실마리를 제공하고자 한다.

    재료 및 방법

    1. 정소 조직 및 세포 준비

    본 실험에 사용된 정소는 경기도 양평 인근 농장에서 사육된 5일령 돼지에서 거세된 정소를 구하여 사용하였다. 거세된 돼지 정소는 1cm x 1cm 크기로 절편하고 급속 냉동 후 -70℃에 보관하였고, 조직 분석을 하기 위해 Bouin’s solution (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)에 고정하였다.

    채취된 정소를 IV형 collagenase (Life Technologies, Waltham, MA, USA)를 사용하여 해리하였다. 분리된 세포를 0.2% 젤라틴으 로 코팅된 배양접시에서 배양하였다. Neurotrophic factor, leukemia inhibitory factor, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor가 포함된 stempro-34 배지를 정원줄기세포 배양에 사용하였다. 효소 처리된 정소를 phosphate-buffered saline (PBS)로 씻고 40❍m nylon mesh로 여과 후, 세포를 수집하기 위해 20%와 40%의 2가지 percoll densities (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 세포 현탁액(2ml of 5 x 106 cells/ml)은 percoll densities가 들어 있는 tube 상단에 넣고 4도에서 10분간 600xg로 원심분리하여 상단 (40% percoll)에서 sertoli cell를 수집하여 사용하였다.

    2. 유전자 발현 분석

    Qiagen RNA extraction kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)을 이용하여 5일령 돼지에서 정소, 정원세포, Sertoli cell에서 total RNA를 회수 후, 1❍g의 total RNA로 RT-PCR premix kit (Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 cDNA 합성을 하였다. AccuPower PCR PreMix kit (BIONEER, Daejeon, South Korea)를 이용한 PCR 반응은 Preheat 95℃ 5분후, 95℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 20초의 조건 으로 35회하고 72℃ 5분 반응하였다. RT-PCR에 사용한 primer sets는 Table 1에 정리하였다.

    3. 조직 Hematoxylin & Eosin 염색 분석

    Bouin’s solution으로 24시간 반응시킨 정소 조직을 70~100% (v/v) ethanol에서 탈수하고, xylene에 10분간 2회 처리하여 투명화 시켰다. 투명화 된 돼지 정소 조직은 파라핀으로 고정하여 5❍m 두께로 microtone (thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용해 절편 하였다. Slide glass에 건조된 돼지 정소 조직은 xylene에 10분 처리 후 100% ~ 50% (v/v) ethanol 처리후, hematoxylin (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)에 5분간 반응시키고, 3회 washing후 eosin (Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)에 1분간 처리하였다. 염색된 조직은 DPX mounting medium (Fluka, Buchs, Switzerland)을 이용하여 고정한 후 광학 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였다.

    4. 조직 면역염색 분석

    파라핀을 제거한 조직 슬라이드를 tris-ethylenediamine tetra acetic acid(EDTA) 용액에서 20분간 끓여 항원의 노출을 유도하였다. 슬라이드를 실온에서 식힌 후 2% Bovine serum albumin (BSA, Bovogen Biologicals, Melbourne, Australia), 0.025% Triton-X100을 포함하는 PBS를 1시간 처리하여 세포막의 투과성을 높이고 비 특이적인 결합이 일어나지 않도록 하였다. 이 후 같은 PBS 용액에 1:50 으로 희석된 PAPP-A항체 (SC-3652256; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 1:500으로 희석된 PGP9.5 항체 (7863-0504; AbD Serotec, Raleigh, NC, USA), 1:50으로 희석된 GATA4 항체 (SC-1237; Santa Cruz Biotechnology)를 처리한 후 3회 Washing 후, 1:1000로 희석된 2차 항체를 사용하였다. 1차 항체는 4℃에서 12시간 반응시켰으며, 2차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 4’-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich)를 상온에서 10분간 처리하여 핵을 염색하였고, 형광 현미경 (Nikon) 으로 관찰하였다.

    결 과

    1. 돼지 정원줄기세포와 정소에서의 IGFBP family member의 발현 분석

    돼지 정원줄기세포와 5일령 돼지 정소에서 7 종류 IGFBPs의 발현 수준을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. IGFBPs의 발현 수준은 각 member에 따라 달랐지만 모두 돼지 정원줄기세포 발현되었다(Fig 1). 한편 돼지 정소에서는 IGFBP의 member 중에서 IGFBP 3, 5, 및 7은 높은 수준에서 발현하고 있었으나, IGFBP 1, 2, 4, 및 6의 발현은 상대적으로 낮은 수준에서 발견되었다. 각 IGFBP의 member 간 발현 수준을 비교해 보면, IGFBP 1, 2, 3, 4, 및 6의 발현은 정소보다 정원줄기세포에서 상대적으로 높게 나타난 반면에, IGFBP 5의 발현은 정소에서 상대적으로 더 높게 나타났으며, IGFBP 7은 유사한 수준으로 발현되었다(Fig 1). 이러한 결과로, IGFBP family member중에서 IGFBP 1, 2, 3, 4, 및 6은 정소에 포함되어 있는 정원세포에서 주로 발현되는 것으로 판단되며, 발현 양상이 family member간 다르게 나타나 정자와 정소의 형성 및 발달에 미치는 영향도 다를 것으로 판단된다.

    2. 5일령 돼지 정소에서 PGP9.5, GATA4, PAPP-A 발현 분석

    5일령 돼지 정소에서 PGP9.5, GATA4, PAPP-A가 발현되는 양상을 확인하기 위해 immunohistochemistry를 수행하였다. 그림 2의 결과에서 보여지는 것처럼 정원세포의 표지인자로 활용되는 PGP9.5와 Sertoli cell의 표지인자로 알려진 GATA4가 발현되는 세포의 종류가 확연히 다른 것을 알 수 있었고, PAPP-A의 발현 양상은 PGP9.5 보다는 GATA4의 발현 양상과 유사하여 정원세포에서는 발현 되지 않으며 Sertoli cell에서 발현되는 것으로 예상되었다(Fig 2).

    3. 5일령 돼지 정소에서 PGP9.5와 GATA4의 발현 분석

    5일령 돼지 정소에서 PGP9.5와 GATA4를 발현하는 세포를 알아보기 위하여 PGP9.5와 GATA4에 특이적으로 반응하는 항체를 동 시에 사용하여 면역조직염색을 실시하였다. 그림 3은 PGP9.5를 발현하는 세포와 GATA4를 발현하는 세포는 모두 세정관 내에 존재한 다는 것을 보여준다. 그렇지만 두 유전자의 단백질이 발현되는 세포는 일치하지 않았고, PGP9.5를 발현하는 세포는 정소의 세정관 내강에 위치하고 있었으며 GATA4를 발현하는 세포는 세정관의 기저막 부위로 판단되었다. (Fig 3).

    4. 5일령 돼지 정소에서 PGP9.5와 PAPP-A의 발현 분석

    5일령 돼지 정소에서 PAPP-A를 발현하는 세포를 분석하기 위하여 PGP9.5 항체와 동시에 PAPP-A를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역조직염색을 실시하였다. 그림 3의 결과와 동일하게 PGP9.5를 발현하는 세포는 세정관의 내강에서 발견되었으며, PAPP-A를 발현하는 세포는 세정관의 기저막 부위에 존재하는 것으로 판단되었다(Fig 4). 그림 3과 4에서 제시한 것처럼 간접적으로 PGP9.5와 GATA4를 발현하는 세포와 비교했을 때, PAPP-A의 발현 양상은 GATA4와 유사하여, 5PAPP-A는 5일령 돼지의 정소에서 Sertoli cell에서 발현하는 것으로 판단된다.

    고 찰

    IGF 신호전달 경로는 생식기관의 발달과 기능에 있어서 중요한 역할을 수행하는 경로중의 하나이다Fu 등 2001(). 생쥐의 정소에서 IGF-I 수용체는 Sertoli cell, Leydig's cell 그리고 정모세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다Antich 등 1995(). 또한, 정소에서 IGF-I의 발현이 발달 단계에 따라 다르게 발현하며, 성체에서는 오직 정모세포에서만 발현하는 것으로 알려져 있다Hansson 등 1989(). 본 연구 는 5일령의 돼지 정소에서 IGF system의 한 구성원으로 기능을 수행하는 7종류의 IGFBP member의 발현 양상과 세정관에서 PGP9.5, GATA4의 발현과 비교하여 PAPP-A의 발현 양상을 분석하기 위하여 실시하였다. 그 결과 IGFBP 1, 2, 3, 4, 6와 PGP9.5는 정원줄기 세포에서 PAPP-A는 Sertoli cell에서 발현하는 것으로 관찰되었다.

    IGFBPs는 생체내에서 IGF의 다면발현을 조절해 주는 중요한 인자이다Cohen 2006(). 본 연구에서 IGFBP 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7의 발현을 정원줄기세포와 5일령 돼지 정소에서 비교한 결과, 정원줄기세포에서 IGFBP 1, 2, 3, 4, 6의 발현이 특이적으로 높게 나타났다 (Fig 1). 생쥐의 정소에서 IGFBP 1, 2, 3, 4, 5의 기능이 보고되었지만Lin 등 1993Peters 등 2003(; ), 돼지 정소 내에서 정확한 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 이제까지 보고된 IGFBPs의 발현 양상을 분석해보면, IGFBP 2와 IGFBP 3은 생쥐 leydig cell에서 발현되고 Matsui와 Takahashi 2001Wang 등 1994(; ), IGFBP 4의 발현은 미성숙 돼지 Sertoli cell에서 그리고 IGFBP 5와 IGFBP 6는 사람의 정소에서 발현된다고 보고되었다Bardi 등 1999Zhou와 Bondy 1993(; ). 이러한 보고들은 IGF 신호전달 경로와 system이 정소의 발달 및 정자 생성 과정에 중요한 역할을 수행한다는 것을 의미하며, 따라서 이 신호의 조절자의 하나인 IGFBPs와 PAPP-A도 정소의 발달 및 정자 생성과정에 관여하는 인자로서 기능을 수행할 것으로 판단된다.

    이전 연구에 따르면 미성숙 돼지 세정관 내에는 sertoli cell와 정원세포만 존재하며, 정원세포는 세정관의 내강에 존재하고 Sertoli cell는 세정관의 기저막 부위에 존재하며 GATA4 단백질을 발현하였다Lee 등 2016(). 본 연구에서는 IGFBPs의 기능을 조절해 주는 인자인 PAPP-A 단백질의 발현이 Sertoli cell 특이적으로 발현하였고(Fig 4), Sertoli cell에서 분비된 PAPP-A에 의해 정원줄기세포 내에서 발현하는 IGFBPs의 작용이 조절되어 미성숙 돼지 정소에서 IGF axis가 조절될 수 있다고 예상할 수 있다. 하지만 미성숙 돼지 정소에서 IGFBPs의 기전이 확실하게 밝혀지지 않았으므로 이와 관련된 추가 연구가 필요하다고 판단된다.

    적 요

    생체 조직 내에서 표지인자의 발견은 해당 세포의 특성과 기능을 이해하는 데 매우 중요하다. 이전의 연구에서 본 연구진은 돼지 정원줄기세포에서 특이적으로 IGFBP 3가 발현되어 표지인자로의 가능성을 보고한 바 있다. 본 연구에서는 IGFBP 3이외의 다른 family member가 정원줄기세포에서 특이적으로 발현하는 지와, 이의 발현을 조절하는 PAPP-A의 조직학적인 측면에서의 발현 양상을 5일령 돼지 정소에서 확인하였다. 그 결과 IGFBP 1, 2, 3, 4, 6의 발현은 정소 전체에서 발현되는 수준보다 돼지 정원줄기세포에서 더 높은 수준에서 발현하고 있음을 확인하였다. PAPP-A는 sertoli cell에서 특이적으로 발현하며, 정원줄기세포에서는 발현하지 않는 것을 PGP9.5와의 동시-조직염색으로 확인하였다. 이러한 결과는 Sertoli cell에서 발현하는 PAPP-A 단백질은 미성숙 돼지 정소에서 IGFBP family를 통해 정소 세포의 발달과 분화를 조절할 것으로 판단된다.

    Figure

    JET-33-177_F1.gif

    RT-PCR analysis of IGFBPs in porcine SSCs and 5day old porcine testis. IGFBPs, insulin-like growth factor-binding proteins; SSC; spermagogonial stem cell; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction.

    JET-33-177_F2.gif

    Expression of PGP9.5, GATA4 and PAPP-A in 5day old porcine testis. Arrows indicates positive cells in 5day old porcine testes. PGP9.5 protein gene product 9.5; PAPP-A, pregnancy-associated plasma protein-A.

    JET-33-177_F3.gif

    Co-immunohistochemistry analysis of PGP9.5 with GATA4 in 5day old porcine testes. White arrow indicates cell expression PGP9.5 protein. Yellow arrow indicates cells expressing GATA4. PGP9.5 protein gene product 9.5.

    JET-33-177_F4.gif

    Co-immunohistochemistry analysis of PGP9.5 with PAPP-A in 5day old porcine testes. White arrow indicates cell expressing PGP9.5 protein. Yellow arrow indicates cells expressing PAPP-A. PGP9.5 protein gene product 9.5; PAPP-A, pregnancy-associated plasma protein-A.

    Table

    Primers used for the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of cDNA from porcine spernatgonial stem cells and 5day old porcine testes

    Reference

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